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转基因动物及克隆动物 Transgenic Animal and Clonal Animal 1982年 Palmiter-“超级巨鼠” 华盛顿大学的Palmiter将大鼠的生长激素基因注射到小鼠受精卵内,?培育出体型明显大于正常小鼠的超级鼠,?成果轰动一时。 转基因小鼠A生长速度要比普通小鼠B的生长速度平均快50%。 1987年 世界上第一只商业化转基因  绵羊诞生(Roslin研究所) 1989年 精子载体法应用于转基因动物 1997年 转基因克隆动物(Roslin研究所) 转基因克隆羊Polly:携带有人凝血 因子Ⅸ 1999年 上海遗传研究所宣布转基因试 管牛“滔滔”诞生 三十几年里，转基因动物技术飞速 发展，转基因兔、转基因猪、转基 因牛、转基因鸡、转基因鱼等陆续 育成。转基因动物技术已广泛应用 于生物学、医学、药学、畜牧学等 研究领域 转基因鼠 5只克隆出的转基因小猪 Noel、Angel、Star、Joy和Mary。 全球首只转基因猴“Andy” 转基因鱼 转基因试管牛“滔滔” 英国1990－2000年科研中使用转基因动物的比例图 三十年来，转基因动物经历了 兴起——高潮——现在相对平稳的过程。 其重要意义在于人为实现动物物种之间，甚至动物与植物、微生物之间遗传物质的交换与重组。 如： 改变动物性状 导入抗病基因 二、转基因动物的概念 三、转基因动物培育原理 四、方 法 显微注射法 逆转录病毒法 ES（胚胎干细胞）法 1.方法 显微注射制作转基因动物流程图 2.具体步骤 （1）前期准备 实验动物：供体鼠 、 受体鼠 、结扎雄鼠 仪器设备：拉针仪 、煅针仪、体视镜、显微注射仪 实验试剂耗材：超排激素：PMSG、HCG、 透 明质酸酶（HE）、小鼠胚胎操作和培养液：M2、M16 、注射用矿物油、注射针、持卵针 显微注射仪 （2） 受精卵的采集 （5） 得到founder转基因小鼠（6） 对founder转基因小鼠进行鉴定、筛选、杂交获得纯合转基因小鼠 关于逆转录病毒 1、Retrovirus是只有一条单链RNA的病毒类的总称。 2、逆转录病毒在逆转录酶（RT）的作用下可以将本身的单链RNA作为模板进行复制和遗传信息的传递。 3、逆转录病毒通过病毒中膜糖蛋白和宿主 细胞表面的受体相互作用而进入宿主细胞。 原 理 1、逆转录病毒具有高效感染和在宿主细胞DNA上高度整合的特性。 2、逆转录病毒能作为目的基因载体，通过感染早期胚胎细胞实现基因转移，产生嵌合体动物，再经过杂交、筛选即可获得转基因动物。 关键步骤 （1）逆转录病毒载体的构建? ①提取病毒DNA ②将DNA克隆载体中 ③酶切病毒结构蛋白编码区 ④将外源目的基因克隆到载体 ⑤转染细胞，测定外源基因的表达。? （2）包装细胞? 决定着重组病毒效价及其宿主范围。 常用φ-2细胞株 （3）重组逆转录病毒感染早期胚胎 载体转染包装细胞后与8细胞胚胎共培养进行转染 （4）胚胎移植 （5）建系 关于ES细胞 1、胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）人或动物的胚胎中均存在一些具有高度更新能力和多向分化能力但尚未分化的干细胞，称胚胎干细胞。 2、它与早期胚胎聚集，或被注射到胚胎后，能参与宿主胚胎的发育，形成包括生殖细胞在内的所有组织。 原 理 将外源目的基因导入ES细胞，再移入胚泡期的宿主胚胎，最后将宿主胚胎移植到假孕母鼠子宫内，便可获得由胚胎干细胞介导的转基因动物。 关键步骤 ①ES细胞的分离培养 ②ES细胞基因操作 电穿孔、显微注射、磷酸钙-DNA共沉淀、逆转录病毒感染等方法 ③获取囊胚期胚胎 ④显微操作 ES细胞注射到囊胚期胚胎内 ⑤胚胎移植 优点： 1、整合率相对较高 2、可导入基因片断较长 3、外源基因整合于所有的组织细胞中的概率高 缺点： 1、整合率随机 2、有些动物原核看不清，需经特殊处理才能有效导入 3、需较精密仪器，费用昂贵 优点： 1、胚胎存活率高 2、病毒DNA随机单拷贝整合 3、宿主范围广 缺点： 1、整合率不高，整合位点是随机的 2、后代多为嵌合体动物 3、外源基因易发生重排或丢失 4、病毒载体容量不大 5、病毒DNA序列