第八章 分子生物学研究技术.ppt

因此，为了研究mRNA所包含的功能基因信息，一般将其反转录成稳定的DNA双螺旋（complementary DNA，cDNA)，再插入到可以自我复制的载体中。一个高质量的cDNA文库代表了生物体某一器官或组织mRNA中所含的全部或绝大部分遗传信息。 常用的RNA提取方法：异硫氰酸胍法、盐酸胍法、异硫氰酸胍-苯酚法。 Trizol试剂是使用最广泛的抽提RNA专用试剂，主要由异硫氰酸胍和苯酚组成，可以迅速破坏细结构，使存在于细胞质及核内的RNA释放出来，并使核糖体蛋白与RNA分子分离，还能保证RNA的完整性。 由于RNA酶存在于所有的生物中并且能够抵抗诸如煮沸这样的物理破坏，固此建立一个无RNA酶的环境对于制备优质RNA很重要。对于制备mRNA来说这些预防措施尤其重要。 纯的RNA样品其OD260／OD280应介于1.8-2.0之间， 1）若RNA样品OD260/OD280比值太小，说明有蛋白质或酚的污染； 2）比值大于2.0时，可能被异硫氰酸胍等污染； 在OD260情况下，1 OD值的吸光度相当于单链DNA或RNA为40μg/ml，寡核苷酸为20μg/ml。 寡聚（dT）-纤维素柱层析法利用mRNA 3′端含有Poly（A+）尾巴 的特点，在RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚（dT）纤维柱后，即可得到较高纯度的mRNA。 一、RACE技术 (rapid amplification of cDNA ends) 1、RACE的优点 ①此方法是通过PCR技术实现的，无须建立cDNA文库，可以在很短的时间内获得有利用价值的信息。 ②节约了实验所花费的经费和时间。 ③只要引物设计正确，在初级产物的基础上可以获得大量的感兴趣基因的全长。 获得全长的cDNA； 识别5′和3′端非转录序列；研究转录起 始位点的不均一性，启动子区的保守性 RDA技术原理： 1、Gateway技术的工作原理 Gateway技术采用基于λ噬菌体的位点特异性重组，代替限制性内切酶和连接酶 BP反应创建入门克隆attBDNA序列与attP 供体载体（Donor vector）重组反应 LR反应attL 入门克隆与attR目的载体之间的重组反应 Gateway大规模克隆策略： 第1步：TOPO反应:创建入门克隆，通过PCR或者传统的克隆方法将目的基因克隆连入入门载体（Entry 载体）。 第2步：LR反应：混合包含目的基因的入门克隆和合适的目的载体以及Gateway LR Clonase酶。表达克隆用来在合适的宿主中进行蛋白的表达和分析。 Entry载体上基因两端具有attL1和attL2位点，目的载体上含有attR1和attR2位点，在重组蛋白作用下发生定向重组 ? 1986年提出，根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA顺序，也无需预先知道其表达产物的有关信息，但必须建立遗传分离群体 主要用于与遗传病相关基因等致病基因的克隆 染色体步移（Chromosome Walking ）： 利用已知的基因或分子标记来筛选大片段的DNA文库获得阳性克隆，如此得到的阳性克隆是“一步克隆”，利用获得的克隆作探针对文库进行第二次杂交，得到与探针具有重复序列的阳性克隆称为“二次克隆”，如此反复即可取到需要要得克隆，获得目的基因。 -- 检测基因表达发生或出现的位置和时间。 -- 基因染色体定位。 -- 文库筛选。 应用 四、定点突变技术（site-directed mutagenesis） 突变技术 - 随机突变： 化学物理途径，插入失活（转座子，T-DNA） 缺点：复杂，耗时，检测不易。 - 定点突变（寡聚核苷酸介导突变） 定点突变（寡聚核苷酸介导突变） - 在DNA序列的目的位置设计引物。 引物内引入与模板不同、期望突变的一个或几个碱基。 PCR产物序列中出现期望突变。 重叠延伸PCR突变发生 改变蛋白质分子中氨基酸组成。 在DNA分子中引入酶切位点。 改变DNA分子中与蛋白质结合的位点。 应用 本节要点 技术 SAGE 剪接 原位杂交 定点突变 主要功能 识别特异表达基因 识别基因转录子多样性 识别特定位置表达的基因 体外改变DNA碱基构成 本节要点 技术 SAGE RNA剪接 原位杂交 定点突变 关键词 锚定酶，标签酶，标签串联体 外显子，gDNA，序列比对