蛋白质工程学考试复习.pptx

一、蛋白质工程的概念;蛋白质工程产生的标志;三、蛋白质工程的研究内容;蛋白质工程的支撑技术;如何认识蛋白质？;L-型的氨基酸;构象conformation：组成分子的原子或基团绕单键旋转而形成的不同空间排布 构象转化时不需要共价键的断裂和重新形成 化学上难以区分和分离;1.α-螺旋 结构（α-helix）;β折叠的结构特点 ;在平行（a）和反平行（b）β－折叠片中氢键的排列;3.转角（turn);四、维系蛋白质结构的作用力;第二遗传密码;3.第二遗传密码的特点;一、蛋白质和新生肽链折叠;3.体外蛋白质折叠与细胞内新生肽链折叠的区别;三、帮助蛋白质和新生肽链折叠的生物大分子;molecular chaperone;分子伴侣的定义完全是功能上的。 分子伴侣与酶的异同点 相同点 参与促进一个反应而本身并不在最终产物中出现 不同点 分子伴侣对靶蛋白不具有高度专一性 分子伴侣的催化效率很低 分子伴侣有时只是阻止肽链的错误折叠而不是促进其正确折叠。;1.3分子伴侣在蛋白质分子折叠中的作用;由分子伴侣和靠消耗三磷酸腺苷的能量而发挥作用的特定的蛋白水解酶组成。 分子伴侣帮助新生肽正确折叠；而特定的蛋白水解酶把不能继续正确折叠的或错误折叠的“垃圾”水解成小分子。 ;分诊治疗机制（triage） ;1.熵判据和蛋白质折叠;2.吉布斯自由能判据和蛋白质折叠;1.The Levinthal Paradox;常见“折叠病”;2设计层次分类;1甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸;ⅠMethods;transposons;Ⅲ Oligo-directed site mutagenesis;2.Crossover PCR;Ⅵ Gene fusion and gene link;Methods of Gene fusion and gene link;tRNA-mediated protein engineering Incorporation of non-natural amino acids into proteins;蛋白质化学修饰的意义;概念;体外聚乙二醇修饰（PEG化）;试剂特点：具有氧化性或还原性。 氧化剂：H2O2 ，N-溴代琥珀酰亚胺 可被氧化的侧链基团：巯基，甲硫基，吲哚基（Trp）、咪唑基、酚基等。 还原剂：2－巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)等。 可被还原的侧链基团：二硫键。;1、宿主。表达蛋白的生物体。可以为细菌、酵母、植物细胞、动物细胞等。 由于各种生物的特性不同，适合表达蛋白的种类也不相同。 2、载体。载体的种类与宿主相匹配。根据宿主不同，分为原核（细菌）表达载体、酵母表达载体、植物表达载体、哺乳动物表达载体、昆虫表达载体等。载体中含有外源基因片段。 通过载体介导，外源基因可以在宿主中表达。 3、辅助成分。有的表达系统中还包括了协助载体进入宿主的辅助成分。 比如昆虫-杆状病毒表达体系中的杆状病毒。;关于表达载体的一些分子生物学概念; T7 噬菌体编码的 T7 RNA 聚合酶选择性的激活 T7 噬菌体启动子的转录。 T7 RNA 聚合酶活性高，其合成 RNA 的速度比大肠杆菌 RNA 聚合酶快 5倍左右。并可以转录某些不能被大肠杆菌 RNA聚合酶有效转录的序列。 在细胞中存在 T7 RNA聚合酶和 T7噬茵体启动子的情形下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过 T7 噬菌体转录体系，最终受 T7噬菌体启动子控制的基因的转录达到很高的水平。;核糖体结合位点 外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频 率，而且在很大程度上还与 mRNA 的翻译起始效率密切相关。 大肠杆菌细胞中结构不同的 mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。 mRNA 翻译的起始效率主要由其 5‘ 端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS） ;选择合适的载体;蛋白纯化方法;蛋白质三维结构解析;蛋白质三维结构测定方法及数量;X射线衍射的获得;晶胞(Unit cell) 空间点阵的单位（大小和形状完全相同的平行六面体），是晶体结构的最小单位。;二、X射线晶体结构测定基本过程;晶体的初步鉴定;定义： 核磁共振现象（nuclear magnetic resonance ，NMR）是指核磁矩不为零的核，在外磁场的作用下，核自旋能级发生塞曼分裂(Zeeman splitting)，共振吸收某一特定频率的射频辐射（radio frequency, RF）的物理过程。;二、几个重要波谱参数;NOE与蛋白质结构信息;基因组(genome = gene + chromosome): 生物体所拥有的全套染色体上的全部基因 转录组(transcriptome=transcri