无瓣海桑果实内生真菌分离鉴定与`其抑菌活性.docVIP

无瓣海桑果实内生真菌的分离鉴定及其抑菌活性 　　摘要：基于18S rDNA序列分析和GenBank同源性比较，研究采用平板分离法从红树无瓣海桑（Sonnera-tia apetala）果实中分离得到20株内生真菌，共18个属。分别对20株内生真菌的发酵液进行抑菌活性筛选，其中BGMRC1036T的代谢产物对荔枝炭疽病菌（Colletotrichumzloeosporioides）有较好的抑制作用，BGMRC1123T的代谢产物和BGMRC11095T的代谢产物对番木瓜炭疽病菌有较好的抑制作用，BGM-RCl008T的代谢产物对香蕉黑星病菌（Cladosporiumcucumerinum）表现出较好抗菌活性 关键词：内生真菌；分离；鉴定；抗菌活性 中图分类号：$432.4+4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）09-2252-04 内生真菌（Endophvte）是指那些在生活史的某一段时间能够与健康的宿主组织形成互利共生关系，而且在短时间内不会引起宿主组织发生病变的真菌。研究表明，几乎所有植物中都有内生真菌的存在，目前已从植物内生真菌中发现多种具有抗肿瘤、抗病毒、降血糖、抗菌、杀虫、免疫抑制、酶抑制剂或激活剂等的活性代谢产物。它们在医药业、农业的生物防治方面都显示出重要的应用价值。番木瓜、香蕉和荔枝在生长过程中容易染上一些病原菌，从而影响外观、贮藏和年产量。番木瓜炭疽病菌（Colletotrichumgloeosporioides）、香蕉黑星病菌（CladosporiumcucumeFinum）和荔枝炭疽病菌分别是番木瓜、香蕉和荔枝的3种主要病害的病原菌，目前多采用苯并咪唑类和百菌清等化学药物进行防治。已有研究表明，以上3种病原菌菌株对苯并咪唑类药物的抗性由单基因控制，长期使用易引起基因突变，病原菌抗药性增强，同时，化学抗菌药物的使用也容易导致不同程度的果品污染及农药残留超标，因此寻找新型杀菌剂日益迫切 红树植物常年处于高温、高盐、频繁潮汐、缺氧、强风、强紫外线的独特环境中，致使其内生真菌次级代谢产物结构类型丰富多样，是许多具有各种活性的先导化合物的重要来源之一。本研究从无瓣海桑（Sonneratia apetala）果实中分离鉴定其内生真菌，并对其进行18S rDNA基因鉴定，以确定其分类学地位。同时进行抗菌活性测试，从中筛选出具有抗菌活性物质的产生菌，为新型抗农业病原菌药物的研究、开发和利用提供一定的理论依据 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 样品来源 无瓣海桑果实，采集于广西钦州茅尾海红树林自然保护区 1.1.2 培养基 ①PAD固体培养基：葡萄糖2%、琼脂2%、马铃薯20%、海水素3.3%、氯霉素0.01%、去离子水配制pH6.5：⑦Trehalose-Aspartc Acid（M4）：L-天冬门酰胺1.0g、海藻糖5.0g、复合盐溶液10mL、去离子水1000mL、琼脂粉14g、pH7.2-7.4；③Arginine（M9）：精氨酸1g、甘油6mL、复合盐溶液10mL、去离子水1000mL、琼脂粉14g、pH7.2-7.4；④AGG纯化培养基：淀粉10g、甘油5mL、葡萄糖1g、复合盐溶液10mL、去离子水1000mL、琼脂粉14g、pH7.2-7.4；⑤PDA液体培养基：葡萄糖2%、马铃薯20%、海水素3.3%、氯霉素0.01%、去离子水配制pH6.5：⑥LB纯化培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、pH7.4，去离子水1000mL 复合盐溶液：KNO31.000g、NaCl0.500g、MgSO47H2O0.500g、K2HPO40.500g、NH4NO30.100g、FeSO40.010g、MnClH2O0.001g、ZnSO47H2O0.001g、去离子水100.000mL 1.1.3 指示菌 番木瓜炭疽病菌、香蕉黑星病菌、荔枝炭疽病菌 1.1.4 主要仪器设备 高压灭菌器（HVE-50，日本HIRAYAMAHVE公司）、恒温培养振荡器（ZHWY-2112C，上海智城分析仪器制造有限公司）、多功能梯度PCR仪（TGradient，德国Biometra公司）、电泳仪（TanonEPS-100，上海天能科技有限公司）、冷CCD凝胶成像分析系统暗箱（GelLogic2200Pro，Carestream公司）、旋转蒸发仪（N-1100D-W，日本EYELA公司） 1.2 方法 1.2.1 内生真菌的分离纯化 取无瓣海桑果实，用无菌水冲洗干净，无菌滤纸吸干水分。无菌条件下对其表面消毒：次氯酸钠（含5%有效氯量）浸泡3min→无菌水冲洗3次→75%乙醇浸泡1min→无菌水冲洗3次，并用无菌滤纸吸干表面无菌水。将无瓣海