牛肝细胞原代培养.pdfVIP

牛肝细胞原代培养 1 材料 1.1 牛肝脏来源 用于获得原代细胞的牛肝脏来自南京市郊某小牛血清制备厂，小牛年龄1 2d 。 1.2 主要试剂 II 型胶原酶( collagenase II)和DMEM/F 12 培养基为Invitrogen 公司产品，小牛血清为 明海生物工程有限公司产品，HEPES sodium salt 、两性霉素B 、L-谷氨酰胺、EGTA、牛血 清白蛋白(BSA)为Amresco 公司产品，转铁蛋白、牛胰岛素、台盼蓝为Sigma 公司产品， 地塞米松为Promega 公司产品，6 孔细胞培养板为costar 公司产品。 1.3 采肝脏、 灌注消化及分离肝细胞所用的器械 大号手术剪刀3 把，小手术剪刀2 把，止血钳4 把，长镊子4 把，手术刀柄2 个，刀 片2 片，小镊子4 个，乳胶手套4 付，100 mL 玻璃注射器2 个，导液管3 条，铝饭盒3 个，500 mL 、100 mL 烧杯各2 个，瓶皿2 个，200 目不锈钢网筛1 个，50 mL 塑料离心管 2 个，细胞计数板3 个。 1.4 主要仪器 普通光学显微镜，细胞培养箱，倒置显微镜，超净工作台，冰箱，电热恒温水浴锅， 低速离心机，电子天平。 2 方法 2.1 实验方案 新生小牛采血结束→无菌采取一部分肝后叶→4 ℃冲洗液冲洗掉血液并保存于4 ℃运 送回实验室→37 ℃冲洗液冲洗让肝脏升温→37 ℃水浴锅里灌注消化肝脏→撕开肝被膜分 散肝细胞→过滤沉淀离心→获得纯化的肝细胞→细胞计数和计算即时存活率→稀释细胞 接种于牛尾胶原包被的细胞板→置37 ℃、5% CO2 加湿环境中培养→观察记录细胞生长情 况。 2.2 工作溶液的配制 2.2.1 冲洗液A 分别称取 8.588 g HEPES sodium salt 、7.468 g NaCl、0.234 g KCl、0.228 g EGTA、0.250 g Na HPO ·12H O， 1.0 mol/L HCl 调pH 至7.6， 去离子水定容至1000 mL ，0.22 μm 微 2 4 2 孔滤膜过滤除菌，4 ℃贮存。 2.2.2 冲洗液B 1 分别称取 8.588 g HEPES sodium salt 、7.468 g NaCl、0.250 g Na HPO ·12H O、0.234 g 2 4 2 KCl， 1.0 mol/L HCl 调pH 至7.6， 去离子水定容至1000 mL ，0.22 μm 微孔滤膜过滤 除菌，4 ℃贮存。 2.2.3 三抗液 准备81 mL 高压三蒸水，取5 mL 水溶解100 万微克硫酸链霉素 （一小瓶），取5 mL 水溶解80 万单位青霉素（一小瓶），再从硫酸链霉素瓶和青霉素瓶中分别取回4 mL 和5 mL 溶液，加入到剩下的71mL 高压三蒸水里，然后再加入20 mg 两性霉素B ，混匀，即获得 每毫升含青、链霉素分别为1 万U 和 1 万μg，以及250μg 两性霉素B 的母液，使 时， 在100 mL 细胞培养液中加母液1mL 。 2.2.4 牛肝脏保存运送液 为高压过的生理盐水990 mL 加上10 mL 三抗液母液，4 ℃贮存。 2.2.5 25 mg/mLII 型胶原酶液 称取100 mg II 型胶原酶，溶解在4mL 蒸馏水里，待完全溶解后，0.22μm 微孔滤膜过 滤除菌， 20 ℃贮存。 2.2.6 0.05%胶原酶灌注消化液 分别称取 8.588 g HEPES sodium salt 、7.468 g NaCl、0.234 g KCl、0.333 g CaCl 、0.250 2 g Na HPO ·12H O， 1.0 mol/L HCl 调pH 至7.6， 去离子水定容至1000 mL ，0.22 μm 2 4 2 微孔滤膜过滤除菌，4 ℃贮存，临 时，取147 mL 的该液体加入3 mL 25 mg/mL II 型胶