高糖环境下人骨髓间充质干细胞复合兔脱细胞真皮支架体外成骨能力检测.docVIP

高糖环境下人骨髓间充质干细胞复合兔脱细胞真皮支架体外成骨能力检测 　　[摘要] 目的 探讨脱细胞真皮支架在高糖环境下对骨髓间充质干细胞（hBMSC）的保护作用，以及促进hBMSC向成骨细胞分化的能力。 方法 建立脱细胞真皮基质和含300 mmol/L葡萄糖的细胞高糖模型，在高糖环境下，培养hBMSC为高糖对照组，在高糖条件下，hBMSC种植在脱细胞真皮基质上为基质实验组，正常条件下培养的hBMSC为正常对照组，每组均进行成骨细胞诱导实验。利用MTT实验检测hBMSC的增殖情况；利用骨形成蛋白-1（BMP-1）免疫荧光染色检测hBMSC成骨细胞分化情况，ELISA实验检测各组hBMSC的BMP-1、碱性磷酸酶（ALP）的含量。 结果 与高糖对照组比较，基质实验组hBMSC的细胞增殖光密度（OD值）升高，差异有统计学意义（P 　　1 材料与方法 1.1 细胞来源 GFP标记的人骨髓间充质干细胞（hBMSC）购于广州赛业生物公司 1.2 主要试剂和实验仪器 体重2～3 kg雄性新西兰白兔购自齐齐哈尔医学院动物实验中心[动物合格证号：SYXK（黑，胎牛血清（FBS）、α-MEM培养基、青链霉素和L-谷氨酰胺均购于广州赛业生物公司，地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、VEGF、噻唑蓝（MTT）和葡萄糖等均购于美国Sigma公司，兔抗人BMP-1抗体和TRITC标记羊抗兔IgG购自美国Santa cruz公司，人骨形成蛋白-1（BMP-1）、碱性磷酸酶（ALP）的ELISA试剂盒购于美国RD公司。Emax酶标仪为美国Molecular Devices公司产品，F-7000荧光分光光度计为日立公司产品，BX50型显微镜和SU1510型扫描电子显微镜分别为日本OLYMPUS、日立公司的产品 1.3 实验方法 1.3.1 脱细胞真皮的制备 8只体重2～3 kg雄性新西兰白兔，按照30 mg/kg耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠，常规备皮、消毒，切取背部6 cm×6 cm全层皮肤，清理周围组织后，首先加入0.9%氯化钠溶液，在37℃摇床孵育12 h，去除表皮层[6]；然后置于0.125%胰蛋白酶溶液中，37℃，消化24 h，依次经过0.1%、0.5%十二烷基磺酸钠（SDS）震荡洗涤12 h，60Co消毒处理密封，-80℃保存。扫描电镜观察样品结构[7-8] 1.3.2 细胞培养和实验分组 含10%FBS的α-MEM培养基培养hBMSC，37℃、5%CO2培养者为正常对照组；若α-MEM培养基中含300 mmol/L葡萄糖，则为高糖培养基。在细胞高糖模型下，未进行任何刺激的hBMSC为高糖对照组；将hBMSC种植在脱细胞真皮基质上进行培养则为基质实验组；每组细胞均进行成骨诱导分化。成骨分化培养基为：α-MEM培养基中若含10%FBS、1×10-7 mol/L地塞米松、50 mg/L抗坏血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸钠 1.3.3 MTT法检测细胞增殖情况 按实验分组，或在96孔板底放置脱细胞真皮基质，每组均添加1×104 hBMSC后，在正常条件下培养24 h。每孔加入150 μL含0.1%FBS的正常或高糖α-MEM培养基，37℃、5%CO2条件下培养12 h；每孔加入20 μL的5% MTT孵育4 h，然后添加100 μL二甲基亚砜，492 nm波长测定每个样品吸光度（OD值） 1.3.4 免疫荧光染色 各组分化诱导的hBMSC，DAPI进行细胞核标记，4%多聚甲醛固定，4℃条件下，用兔抗人BMP-1抗体（1∶200）孵育12 h后，添加山羊抗兔IgG（1∶150），DAKO水溶性封片液进行封片 1.3.5 人BMP-1、ALP蛋白的检测 按照人BMP-1、ALP蛋白的ELISA试剂盒说明，裂解各组细胞，提取各组细胞裂解液，ELISA实验检测人BMP-1、ALP蛋白的表达 1.4 统计学方法 所有实验均重复3次，实验数据采用SPSS 18.0软件进行统计，结果以均数±标准差（x±s）表示，并进行方差分析或t检验，以P 　　皮肤的细胞外基质主要由胶原蛋白、纤维蛋白、整合素等多糖或蛋白质构成复杂的三维结构，并具有良好的孔隙率和丰富的细胞活性因子等条件，可以更好地利于体内细胞的生长[16]，如果良好模拟细胞的体内生长基质，将对细胞的生长具有积极作用。近年来发现，MSC、内皮祖细胞（EPC）在静电纺丝制作的三维纳米生物材料上尚能正常生长，并对糖尿病足具有促进愈合的作用[17-18]，这些成果提示，构建脱细胞的皮肤细胞外基质会具有较好的三维立体结构，皮肤基质中的VEGF、EGF等多种细胞活性因子能够促进种植的MSC生长，对维持MSC功能、促进MSC分化具有重要影响。在