以新鲜根段进行AM真菌的分子检测及竞争性侵染研究.PDF

维普资讯 菌 物 学 报 23 (1)：126～132，2004 Mycosystema 以新鲜根段进行AM真菌的分子检测及竞争性侵染研究 郑世学 董秀丽 喻子牛 赵 斌 (华中农业大学生命科学技术学院农业微生物学国家重点实验室 武汉 430070) 摘 要：运用nested—PCR技术和 AM真菌特异性引物，建立了用新鲜植物根段直接检测AM 真 菌的分子生物学方法。以真核生物通用引物 LR1和NDL22对混合接种的西红柿新鲜根段进行 第 1次扩增，将其产物进行稀释，再分别以Glomusintraradices和Glomusmosseae的种特异性 引物 8．22和5．25进行第2次扩增。在琼脂糖凝胶上观察到AM真菌种特异性条带：运用该技 术检测出混合接种时同一根段 内不同的AM真菌，并探讨了真菌在植物根部的竞争性侵染。用 盆栽方式种植西红柿，混合接种 G．intraradices和 G．mosseae，在 1个月后，前者侵染 占优势。 关键词：西红柿，根 内球囊霉，摩西球囊霉，nested—PCR 中图分类号：Q939．96 文献标识码：A 文章编号：1672—6472 (2004)01—0126．0132 丛枝菌根 (arbuscularmycorrhiza，AM)真菌存在于 80％以上的维管植物中，具有促进植 物对磷等营养元素吸收的重要作用 (Smith Read，1997)。AM 真菌分属于 6个属 (Morton， 1990)，已发表的种有 170多个 (李晓林和冯固，2001)。AM 真菌在植物根的皮层形成泡囊 (vesicles)和丛枝 (arbuscules)状结构，可以通过曲利苯蓝 (trypanblue)等组织染色方法加 以鉴别 (TrouvelotKough，1986)。尽管Dodd等 (2000)从理论上总结了不同属的AM 真菌 在根内的解剖学差异，但在实际工作中仍然难以区分；即使磷水平等土壤因子的改变，也会使 其形态发生很大的变化(Amijeeeta1．，1989)。特别是在几种AM真菌同时感染某一植物根段时， 研究其在根部的侵染和竞争关系更为困难。近年来，在研究核糖体DNA序列的基础上 (Simon eta1．．1992；VanTuineneta1．．1998)，设计出了AM 真菌种或属水平的特异性引物。提取感染 根段或孢子内的真菌 DNA，或者用经过曲利苯蓝染色后的感染根段进行 PCR 或 nested—PCR 扩增，实现了AM 真菌的特异性检测(Simoneta1．，1992；VanTuineneta1．，1998；Clappeta1．，2001； Rodriguezeta1．．2001)，但过程都比较复杂。 本研究用特异性引物直接对接种 AM 真菌的新鲜植物根段进行 nested—PCR，简化了AM 真菌的分子检测技术，所需根样少，检测的灵敏度高。探讨了混合接种时不同AM真菌在植物 根部竞争侵染动态及相互关系。 1材料与方法 1．1试验材料 以西红柿 (LycopersiconesculentumMil1．)正粉一号作为供试植物，江苏正大种子有限公 国家 自然科学基金(n0和欧盟项 目INCO—DEVProjectICA4C·T2·000—30014资助 ’通讯作者，E—mail：—bin— zhao~mail．hzau．edu,cn 收原稿13期：2003—05—09，收修改稿13期：2003．09．08 维普资讯 1期 郑世学等：以新鲜根段进行AM 真菌的分子检测及竞争性侵染研究 127 司出品。籽粒饱满的健康种子经无水酒精处理3min，2％NaC10溶液浸泡 5min后，用无菌水 反复清洗。表面消毒后的种子置于水琼脂平皿内于室温下催芽。 以GlomusintraradicesN．C．Schenck S．E．Smith和 Glomusmosseae(Nico1．Gerd．)Gerd． Trappe作为供试AM 真菌。接种剂为植物根段、AM 真菌孢子和根外菌丝等土壤混合物。 1．2盆栽种植 采集耕作土壤，pH值6．8，风干，过筛 ( 5mm)后与洗净的河砂 l：l(v／v)混合均匀。