第2章酶与细胞的固定化.ppt

复习问题 为什么要进行细胞固定化? 细胞固定化相对固定化酶有什么优缺点及其应用领域? 第五节 固定化酶和固定化细胞的表征 评价固定化酶（细胞）的指标 固定化酶（细胞）的活力测定：应注明反应温度、pH、底物外，还应流注明搅拌速度、搅拌时间、测定系统类型 活力单位定义及表示方法:μmol.min-1.mg-1; 或μmol.min-1.cm-1(酶板、酶管、酶膜） 固定化酶活力的测定方法与游离酶不同,要做适当的改进之后才能用于固定化酶的测定;目前有二种基本的测定系统:填充床和均匀悬浮保温系统. 第五节 固定化酶和固定化细胞的表征 测定方法分为间歇测定和连续测定两种: 间歇测定:在搅拌或振荡反应器中,间隔一定时间取样,过滤后按常规进行测定.此法简单,但受反应器形状、大小及反应液量影响，必须固定条件下测定；尽可能在达到最高反应速度的振荡或搅拌条件下进行。 连续测定：固定化酶装入具有恒温水夹套的柱中，以不同流速流过底物，测定酶柱流出液，根据流速与酶活力的关系算出酶活力。测定条件要尽量与工程条件相同。 第五节 固定化酶和固定化细胞的表征 2.偶联率及相对活力的测定: 活力回收:指固定化后固定化酶(或细胞)所显示的活力占被固定的等当量游离酶(细胞)总活力的百分比.即:固定化酶总活力/加入酶总活力*100% 偶联率:载体上固定的蛋白量占加入蛋白总量的百分比（加入蛋白活力-上清液蛋白活力）/加入蛋白总活力*100% 相对活力：固定化酶总活力/（加入酶总活力-上清液中末偶联的酶活力）*100% 第五节 固定化酶和固定化细胞的表征 3.固定化酶(细胞)的半衰期 固定化酶(细胞)在连续测定条件下,活力下降为最初活力一半时所经历的时间,称为半衰期. 半衰期是衡量固定化酶(细胞)稳定性的指标. T1/2=0.696/KD KD(衰减常数）=(-2.303/t)(lgE/E0) 第五节 固定化酶和固定化细胞的表征 二、载体活化程度和固定化配基密度的测定 （一）活化程度的测定： 常用茚三酮法测定载体活化的程度：茚三酮与伯胺反应生成一种带色的复合物，叫赫曼紫，这种反应能用于测量结合到不溶性载体上的自由伯胺的数量，载体的活化程度可通过测定伯胺的数量来衡量。 第五节 固定化酶和固定化细胞的表征 二、载体活化程度和固定化配基密度的测定 （二）固定化的蛋白质测定： 1.双辛可宁酸法(BCA) 2.考马斯亮蓝法 第五节 固定化酶和固定化细胞的表征 二、载体活化程度和固定化配基密度的测定 （三)氨基、酰肼或巯基的定量测定 利用2，4，6-三硝基磺酸盐（TNBS）与不同基团的显色反应的不同判断固定化程度，或活化程度。 第五节 固定化酶和固定化细胞的表征 二、载体活化程度和固定化配基密度的测定 （四）酰胺功能团的检测：酰胺功能团能还原Cu 2+到Cu+，可与双辛可宁酸显色。 （五）对固定化亲和素或链亲和素上生物素结合位点的检测： （六）偶联配基的测量： （七）固定化配基的直接吸收扫描 （八）用埃尔梅试剂测量巯基 第五节 固定化酶和固定化细胞的表征 三、亲和技术中固定化配基的容量和活性测量： 1。总结合容量的测量： 2。比活力的测量 第六节 固定化酶与固定化细胞的应用 一. 生物化学及分子生物学基础研究 酶的结构与功能研究 阐明酶反应机理 酶亚基性质的研究 提示酶原激活的机理 研究蛋白质-核酸分子结构 第六节 固定化酶与固定化细胞的应用 生物活性蛋白的定向固定作为揭示蛋白质内部反应和功能的工具 用合适的抗体进行蛋白质的定向固定 利用单克隆抗体进行酶的固定化：通常有二种固定化的方式，即只通过吸附作用进行固定或通过共价方式固定。 利用合适的多克隆抗体进行蛋白酶的固定 分离伴刀豆蛋白A(Con A)所用的生物亲和吸附剂的制备 利用抗鼠蛋白中特定的Fc进行固定. 第六节 固定化酶与固定化细胞的应用 利用糖蛋白中的糖组分实现定向固定: 利用硼酸盐亲和凝胶定向固定 利用金属络合物的定向固定 生物素-亲和素系统 利用定点诱变实现蛋白定位吸附 第六节 固定化酶与固定化细胞的应用 二. 亲和分离系统 从亲和分离的目的和模式综合考虑,可分为三种类型: 亲和色谱:将某种作为配基的生物分子偶联于固相载体上制成亲和吸附剂,用作色谱的填料来分离与之特异性结合的配体. 去除特定污染物:将配基偶联于载体上用于选择性地去除某些污染物. 细胞标记、分离和性质研究：将细胞表面抗原分子对应地抗体偶联于载体上。 第六节 固定化酶与固定化细胞的应用 三. 药物控释载体： 药物控释:就是利用适当的固定化技术或其他定向技术控制药物在体内的释放时间和空间,从而提高药物的治疗效果,减少药物的毒副作用. 为什么要进行药物控释? 固定化技术在药物控释中的作用示例: 聚合物修饰; 凝胶包埋; 微球制剂; 脂质体; 导向药物 第六节