非糖基化促红细胞生成素的聚乙二醇定点修饰和修饰产物性质.pdf

V01．3l 高等学校化学学报 No．1l OF 2010年11月 CHEMICALJOURNALCHINESEUNIVERSmES 2239—2245 非糖基化促红细胞生成素的聚乙二醇定点 修饰及修饰产物性质 郝素娟1，汪音爵2…，康爱君4，刘永东2，李秀男2，石红2， 马润宇1，马光辉2，苏志国2 (1．北京化工大学生命科学与技术学院，北京100029； 2．中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室，北京100190； 3．中国科学院研究生院，北京100049；4．北京大学医学部实验动物科学部，北京100083) 摘要临床用重组人促红细胞生成素(rhEp0)是中国仓鼠卵巢细胞(chin∞e}la脚tero’ralyceu，cH0)表达的 糖蛋白，糖基对稳定蛋白的结构和生物活性非常重要，但cH0表达体系生产成本高、产量低．以大肠杆菌 表达的促红细胞生成素为非糖基化蛋白(rh—ngEpo)，对其进行聚乙二醇(PEG)修饰可以提高蛋白稳定性和 体内循环半衰期．本文采用分子量为20000的N-末端专一性的单甲氧基聚乙二醇．丙醛(mPEG．ALD)修饰 rh—ngEpo，对影响修饰反应的因素进行了考察．结果表明，在最佳反应条件下，单修饰率可达55％．修饰混 合物经离子交换层析分离，获得了纯度大于95％的单修饰产物，其二、三级结构证明与原蛋白相似．肽图分 析结果表明，PEG绝大部分修饰在蛋白N一末端的氨基酸残基上．EusA分析表明，单修饰产物的体外活性虽 然比修饰前减少30％，但热稳定性得到显著增强，在SD大鼠体内的药代动力学性质得到显著提高．研究结 果表明，PEG可以在一定程度上替代糖基的作用，PEG修饰的非糖基化Epo有望成为一种新型的促红细胞 生成蛋白药物． 关键词促红细胞生成素；非糖基化；聚乙二醇修饰；单甲氧基聚乙二醇一丙醛 中图分类号0629．73 文献标识码A 文章编号0251JD790(2010)1l-2239J0r7 I隘床上主要用于治疗慢性肾功能衰竭以及AIDs病人及肿瘤病人化疗引起的贫血等，疗效极为显著呤】． 的糖蛋白，针对这种糖蛋白所开发的长效制剂也已应用于I临床旧J，但都存在产量低、成本高的问题， 不适合慢性贫血病人的长期治疗． 大肠杆菌表达系统是目前最常用的外源蛋白表达系统，它具有生长速度快、周期短、培养条件简 单、安全性好和价格低廉等优点．据文献[9]报道，大肠杆菌表达的Epo由于没有糖基而可能丧失体 内生物活性，但这一缺点可以通过PEG修饰技术得以弥补¨0|．PEG修饰通过减少肾清除、降低免疫原 性及减少酶解等改善蛋白质药物的药代动力学性质，从而提高蛋白质药物的循环半衰期，增强体内药 效，目前已成功用于多种蛋白药物的长效制剂研发¨卜14J． 基于以上思路，我们¨5j通过重组大肠杆菌成功地制备出非糖基化促红细胞生成素(dl—ngEpo)纯 品，并采用SC—PEG对其进行修饰，初步结果证明，修饰后的rIl—ngEp0体内循环半衰期较原蛋白显著 延长．为了克服Sc-PEG易于水解及所得产物修饰位点不专一、重复性差的缺点，本文采用对蛋白质 收稿日期：20lO旬1．21． 联系人简介：刘永东，女，博士，副研究员，从事基因重组蛋白药物分离纯化、修饰及稳定性研究．E-mail：ydliu@h啪e．ipe．∞．cn 万方数据 高等学校化学学报 V01．31 高活性的修饰产物：16]．考察了影响修饰反应的关键因素，得到了反应的最佳条件．修饰混合物经分离 纯化后，获得了纯度大于95％的单修饰产物，结构分析表明，PEG修饰对蛋白的二、三级结构无不利 影响．尽管修饰降低了原蛋白的体外活性，但蛋白的热稳定性和药代动力学性质比修饰前显著提高． 以上结果表明，采用PEG修饰的非糖基化Epo有望成为一种新的促红细胞生成药物． 1 实验部分 1．1试剂与仪器