苹果酸酶结合域定点突变对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸类似物催化性能的影响.pdfVIP

第33卷 第4期 应 用 化 学 Vol_33Iss．4 2016年4月 CHINESEJ0URNALOFAPPLIEDCHEMISTRY Apr．2016 苹果酸酶结合域定点突变对烟酰胺腺嘌呤 二核苷酸类似物催化性能的影响 侯淑华 纪德彬 刘武军 王 磊 (“渤海大学化学化工学院 辽宁 锦州 121013；中国科学院大连化学物理研究所 辽宁 大连 116023) 摘 要 通过对苹果酸酶(ME)辅酶结合域 L310、Q4Ol、IA04饱和位点突变库与辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD )类似物库的高通量筛选，研究了苹果酸酶结合域位点对NAD 及其类似物 (B1～B7)催化活性的影 响。结果表明，突变后酶ME—Q4OlH／L404T对类似物B4的koJ 是野生型酶的50倍；突变后酶ME—L31OM／ Q401N对类似物B4的 ／ 是野生型酶的16倍，对类似物B3的k~~,t／Km是野生型酶的5倍 ，因此通过对结 合域定点突变，NAD 类似物的催化活性得到提高。 关键词 苹果酸酶；定点突变；辅酶活性 中图分类号：O529．8 文献标识码：A 文章编号 ：1000-0518(2016)04-0436-06 DOI：10．11944／j．issn．1000-0518．2016．04．150268 生物体 内时刻进行着氧化还原反应，而这些氧化还原反应的发生离不开氧化还原酶及其辅酶即烟 酰胺腺嘌呤二核苷酸 (nicotinamideadeninedinucleotide，NAD )的参与u；同时氧化还原酶催化制备手 性化合物如手性醇 j、手性胺 J、羟基酸、氨基酸，具有极大的优势，因此在药物化学、农药等领域具有 非常重要的用途，越来越受到人们的重视 。目前，用来制备有机化合物的生物方法包括纯酶催化、粗 酶液和全细胞催化；纯酶催化需要涉及到酶的纯化，增加成本；而粗酶液和全细胞催化会引起其它副反 应。我们利用人工氧还酶体系的粗酶液催化反应，得到单一产物，降低了副产物的生成。这种人工氧还 酶体系是由非天然辅酶烟酰胺 5一氟胞嘧啶二核苷酸 (NFCD)和苹果酸酶突变体组成，粗酶液 中的 NAD 依赖型酶不能够利用 NFCD，降低了副产物的生成；同时通过定点突变增加了突变苹果酸酶利用 NFCD能力 ，提高了催化效率 。近年来，通过对酶进行分子改造已成为改善及拓展酶催化功能的一种 有效手段 引。例如通过基因突变技术，使 NADP依赖型酶变为 NAD 依赖型酶 【1。。，使苹果酸酶识别 NAD 类似物 ¨ ，从而改变了酶对底物的专一性；定点突变也可以提高酶的催化活性，对亚磷酸脱氢 酶 (VFDH)的Glu175和Ala176两个位点进行突变，辅酶NADP催化活性提高了1000倍 ¨；通过定点突 变技术确定了猪蛔虫中苹果酸酶D361与R370在与NAD 结合过程中的作用n 。因此，通过对酶的不 同结构域突变可发现与酶的催化活性、稳定性、底物特异性、对映选择性等密切相关的活性位点，这对于 进一步认识酶的结构与其功能的关系具有重要意义。 前期我们合成了含有 1，2，3-三唑的NAD 类似物(图1)，能够被野生型的苹果酸酶所识别，但是二 者之间的相互作用较弱，催化活性较低 ¨ ，同时也构建了苹果酸酶突变库，在辅酶结合部位选择双位点 进行饱和突变，获得多种突变体。本文尝试对 1，2，3一三唑的NAD 类似物与突变库进行高通量筛选，获 得高催化活性配对，进而考察这些位点及其突变氨基酸对酶催化性能的影响，为酶与辅酶相互作用机制 提供理论依据。 2015-07-28收稿，2015—11-02修回，2015-12-08接受 通讯联系人：侯淑华，讲师；Tel／Fax：0416-3400302；E．mail：housh@ciac．as．c／l；研究方向：有机化学 第4期 侯淑华等：苹果酸酶结合域定点突变对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸类似物催化性能的影响 437 O o