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实验四 酶联免疫吸附试验（ELISA) 免疫标记技术 定义： 将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。 分类： 放射免疫测定法：131I，32P 免疫荧光技术：FITC，PE 免疫酶测定法：HRP，AP 免疫酶测定法(Enzyme ImmunoAssay,EIA) 用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。 辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP) 特点： 高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性 高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测 定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值 分类： 酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体 酶免疫组化法： 组织中或细胞表面的抗原。 酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA) （1）利用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接（或建立关联）。 （2）通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。 它将酶促反应的高效率和免疫反应的高度专一性有机地结合起来，可对生物体内各种微量有机物的含量进行测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。 直接法（direct ELISA）： 将已知抗原直接吸附于载体，加酶标抗体 检测抗体 间接法（Indirect ELISA）： 将已知抗原吸附于固相载体，加酶标记二抗 检测液相中未知抗体 双抗体夹心法（Sandwich ELISA)： 将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗 检测液相中的可溶性抗原 竞争法（Competitive ELISA) ： 将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体 检测液相中的可溶性抗原或抗体 酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA) 间接法测定猪瘟抗体 ——定性检测 实验材料 猪瘟病毒（CSFV） —— 抗原 样品 —— 待测猪血清 HRP标记猪抗兔IgG —— 二抗 包被缓冲液：0.025M pH9.6碳酸盐缓冲液 洗涤液：含0.05% Tween 20的0.01M pH7.4 PBS 底物缓冲液： pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液 底物溶液：TMB ，底物缓冲液，30% H2O2 酶标板，酶标仪 实验方法 实验方法 具体操作步骤 1、取已包被猪瘟病毒抗原的酶标板（根据样品多少，可拆开分次使用），用样品稀释液（PBS）将待检样品1∶40稀释后加入板孔中，每孔加100μl。同样1∶40稀释阴、阳性对照血清，阴、阳性对照各设1孔，每孔100μl。另设一空白对照孔，空白对照孔加100μl稀释液。轻轻振匀孔中样品（勿溢出），置37℃温育30分钟。 2、洗板：甩掉板孔中的溶液，用洗涤液洗板3次，200μl/孔，每次在干净吸水纸上拍干。 3、每孔加酶标二抗（抗猪IgG-HRP结合物）100μl，置37℃温育30分钟。 4、洗板：洗涤3次（方法同步骤2）。 5、显色与终止：每孔加底物A液、B液各1滴(50μl)，混匀。室温避光显色，10分钟后，每孔加终止液（0.25% 氢氟酸）1滴(50μl)，终止反应。 6、15分钟内测定结果。采用波长630nm的酶标仪测定OD值。检测样本的OD值≥0.35为阳性。 预期结果 阳性：显色为黄色（蓝色） 阴性：无色 注意事项 洗涤彻底，避免交叉污染。 按顺序加样，孔底无气泡。 包被和温育在湿盒内进行。 * 用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗体或抗原的方法。 1.定义 2.原理 3.分类 （1）? 直接法测定抗原 A.????? 将抗原吸附在载体表面； B.????? 加酶标抗体，形成抗原—抗体复合物； C. 加底物。底物的降解量＝抗原量。 （2）间接法测定抗体 A.????? 将抗原吸附于固相载体表面； B.????? 加抗体, 形成抗原-抗体复合物; C.????? 加酶标抗体； D. 加底物。 测定底物的降解量＝抗体量。 （3）双抗体夹心法测定抗原 A.????? 将抗体吸附于固相表面; B.????? 加待检抗原，形成抗原-抗体复合物; C.???? 加酶标抗体; E. 加底物。底物的降解量＝抗原量。 （4）竞争法测定抗原 A.???? 将抗体吸附在固相载体表面; B. 加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体； 对照只加入酶标抗原； C. 加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差＝未知抗原量。 4. 原理（以间接ELISA为例）： 显色 间接法测定猪瘟抗体 ——定性检测 1.抗原的处理： 2.包被抗原： 取酶标板，加入100μL/孔的抗原稀释液 4℃，湿盒内，18h 取出包被好抗原的酶标板（4孔/组），甩干孔内液体 以洗涤