ELISA疑难解答提示-Abcam.PDF

ELISA 疑难解答提示 ELISA 的详细疑难解答技术 1. 阴性对照产生了阳性结果阴性对照产生了阳性结果 阴性对照产生了阳性结果阴性对照产生了阳性结果 试剂试剂/样品污染样品污染 试剂试剂 样品污染样品污染 可能是试剂或样品受污染，或者由于孔间溅射而造成交叉污染。可使用新鲜试剂和小心操作 移液器 。 夹心夹心 ELISA – 检测抗体与包被抗体间出现交叉反检测抗体与包被抗体间出现交叉反 夹心夹心 检测抗体与包被抗体间出现交叉反检测抗体与包被抗体间出现交叉反 检查是否选用了正确的包被抗体和检测抗体，确保二者不会有交叉反应。 洗板不充分洗板不充分 洗板不充分洗板不充分 将洗涤缓冲液加入孔中洗涤 ，确保孔区域洗涤充分。确保已在洗涤前弃去了所有残留的抗体 溶液 。 使用了过多抗体使用了过多抗体，而导致非特异性结合，而导致非特异性结合 使用了过多抗体使用了过多抗体，，而导致非特异性结合而导致非特异性结合 查看推荐的抗体用量 。尝试减少抗体用量。 2. 整板出现高背2. 整板出现高背景景 2. 2. 整板出现高背整板出现高背景景 偶联过强或反应时间过长偶联过强或反应时间过长 偶偶联过强或反应时间过长联过强或反应时间过长 检查偶联物的稀释度，在推荐的稀释度下使用。一旦酶标板显色程度已足以进行吸光度读取， 即可使用终止缓冲液终止反应。 底物溶液或终止液不新鲜底物溶液或终止液不新鲜 底物溶液或终止液不新鲜底物溶液或终止液不新鲜 使用新鲜的底物溶液 。终止液应是澄清的 （如果它变黄，则表明已污染，应进行更换）。 未终止反未终止反 未终止反未终止反 如果未终止底物反应，将持续显色。 在酶标仪上读取前在酶标仪上读取前，酶标板放置时间过长，酶标板放置时间过长 在酶标仪上读取前在酶标仪上读取前，，酶标板放置时间过长酶标板放置时间过长 将持续显色 （即便已添加终止液，也会以较慢速率显色）。 实验室玻璃器皿带来污染物实验室玻璃器皿带来污染物 实验室玻璃器皿带来污染物实验室玻璃器皿带来污染物 确保试剂新鲜并且在干净的玻璃器皿中制备 。如有可能，提前对玻璃器皿灭菌。 在光照中进行底物孵育在光照中进行底物孵育 在光照中进行底物孵育在光照中进行底物孵育 底物孵育应在黑暗中进行 。 ELISA 疑难解答提示 孵育温度过高孵育温度过高 孵育温度过高孵育温度过高 抗体在正确温度下将具有最佳结合活性 。确保孵育在正确温度下进行，并且孵育器设置在正 确温度下工作 。孵育温度可能需要进行某些优化。 抗体出现非特异性结合抗体出现非特异性结合 抗体出现非特异性结合抗体出现非特异性结合 确保封闭步骤包括在内并且使用的是合适的封闭缓冲液 。我们推荐使用 5-10% 来自二抗相同 物种的血清或牛血清 。 确保孔已经过预处理以防止非特异性附着 。使用亲和纯化的抗体，最好是预吸附的。 另请查看另请查看 “阴性对照产生了阳性结果“阴性对照产生了阳性结果”下列出的建议”下列出的建议 另请查看另请查看 ““阴性对照产生了阳性结果阴性对照产生了阳性结果””下列出的建议下列出的建议 3. 吸光度值偏低3. 吸光度值偏低 3. 3. 吸光度值偏低吸光度值偏低 靶蛋白在所用样品中未表达靶蛋白在所用样品中未表达/靶蛋白在所用样品中低水平表达靶蛋白在所用样品中低水平表达 靶蛋白在所用样品中未表达靶蛋白在所用样品中未表达 靶蛋白在所用样品中低水平表达靶蛋白在所用样品中低水平表达 检查靶蛋白的表达谱，确保它将会在样品中表达。如果存在低水平的靶蛋白表达，则要增大 样品用量样品用量，，或者可能需要更换为更为灵敏的测定方法或者可能需要更换为更为灵敏的测定方法 。。确保使用在测定方法的检测范围内的确保使用在测定方法的检测范围内的 阳性对照。 抗体不足抗体不足 抗体不足抗体不足 检查是否使用了推荐的抗体量 。可能需要增大抗体浓度以优化结果。 底物溶液不新鲜或配方不恰当底物溶液不新鲜或配方不恰当 底物溶液不新鲜或配方不恰当底物溶液不新鲜或配方不恰当 使用前配制底物溶液 。确保母液未过期、保存方式正确，并且在正确浓度下使用。确保按说 明在正确浓度下使用试剂。 试剂不新鲜或者试剂不新鲜或者 pH 不正确不正确 试剂不新鲜或者试剂不新鲜或者 不正确不正确 确保试剂已正确制备且未过期 。 孵育时间不够长孵育时间不够长 孵育时间不够长孵育时间不够长 如果建议了孵育时间，确保抗体孵育时间达到推荐的时长。可能需要延长孵育时间以优化结 果。 孵育温度过低孵育温度过低 孵育温度过低孵育温度过低 抗体在正确温度下将具有最佳结合活性 。确保孵育在正确温度下进行，并