天津大学,生物化学,课件第五章45节修改.ppt

第四节 核酸的提取、分离和测定 一、RNA的分离提取1 一、RNA的分离提取2 一、RNA的分离提取3(1) 一、RNA的分离提取3(2) 一、RNA的分离提取4 一、RNA的分离提取5 二、DNA的提取和分离 三、核酸含量的测定1 三、核酸含量的测定2 三、核酸含量的测定2 第五节 核酸的变性、复性与杂交 一、变性1 一、变性2 一、变性3（Tm值1） 一、变性3（Tm值2） 一、变性3（Tm值3） 一、变性3（Tm值4） 一、变性3（Tm值5） 二、复性1 二、复性2 二、复性3（影响因素） 三、核酸的杂交1 三、核酸的杂交2 （一）核酸研究的主要工具酶 1．核糖核酸酶类（RNA酶类1） 1．核糖核酸酶类（RNA酶类2） 1．核糖核酸酶类（RNA酶类3） 2．脱氧核糖核酸酶类（DNA酶1） 2．脱氧核糖核酸酶类（DNA酶2） 2．脱氧核糖核酸酶类（DNA酶3-1） 2．脱氧核糖核酸酶类（DNA酶3-2） 2．脱氧核糖核酸酶类（DNA酶3-3） 2．脱氧核糖核酸酶类（DNA酶3-4） 3．非专一性核酸酶类1 3．非专一性核酸酶类2（1） 3．非专一性核酸酶类2（2） （二）核酸的杂交技术1 （二）核酸的杂交技术2 （二）核酸的杂交技术3（1） （二）核酸的杂交技术3（2） （二）核酸的杂交技术3（3） 四、核酸序列分析1 四、核酸序列分析2(1) 四、核酸序列分析2(2) 是1979年，Arber、Smith和Nathams等人在细菌体内发现的一类对DNA具有极高碱基专一性的内切酶。 是DNA顺序测定，基因分离和基因体外重组等研究中十分重要的工具酶。 这类酶主要降解外源的未经特殊修饰的DNA，但不降解自身细胞的DNA。 一般识别顺序包含4-6个碱基对。 （3）限制性内切酶(限制酶) 大多数限制性内切酶的识别顺序具有回文结构（反向重复序列）。 （3）限制性内切酶(限制酶)2 T T A G C A C G T G C T A A A A T C G T G C A C G A T T 反向重复 3， 5， 3， 5， 大多数酶切割后形成粘末端 （3）限制性内切酶(限制酶)3 G A A T T C C T T A A G 3， 5， 3， 5， EcoRI G A A T T C C T T A A G 3， 5， 3， 5， + 粘性末端 粘性末端 少数酶切割后形成平整末端 （3）限制性内切酶(限制酶)3 G T Py Pu A C C A Pu Py T G 3， 5， 3， 5， HindII 平整末端 G T Py Pu A C C A Pu Py T G 3， 5， 3， 5， + （1）蛇毒磷酸二酯酶 （2）牛脾磷酸二酯酶 对RNA、DNA都有作用，是从核苷酸链的3，—羟基端开始，逐个切开5，－ 核苷酸与相邻核苷酸之间的酯键，得到5，－核苷酸。 （1）蛇毒磷酸二酯酶 P P P H2O OH P P P OH OH + 可作用RNA和DNA，是从5，-羟基端开始，逐个切开3，-核苷酸与相邻核苷酸之间的酯键，得3，—核苷酸。 P P P H2O OH + （2）牛脾磷酸二酯酶 P P OH P P P OH 意义：核酸杂交可以在液相或固相上进行，是基因工程和分子生物学的重要技术之一。是鉴定阳性重组体、筛选基因、确定DNA的同源性、研究基因定位、组建DNA的物理图谱、研究DNA的间隔顺序等的有效手段。 原理:核酸（DNA）的变性和复性的性质，也就是在带有互补顺序的同源单链间的配对过程中，DNA单链可重新形成双链，DNA单链也可与RNA互补成为杂交分子。因此有DNA类、DNA-RNA类两种杂交。如把已知序列的分子预先用放射性同位素（32P）标记（称为探针，Probe），即可用其识别或“钓出”另一分子中的同源部分。 Southern 印迹法:利用上述原理，1975年英国分子生物学家E.M.Southern首先发明的一种杂交 “印迹法”。 此法是将凝胶上的DNA片段转移到硝酸纤维素膜上后，再进行杂交 具体方法参见北大P352,353。 1．将DNA样品经限制性内切酶降解后，用琼酯糖凝胶电泳进行分离 2．将胶浸泡在碱（NaOH）中使DNA变性 3．将变性DNA转移到硝酸纤维膜上（膜只吸附变性的DNA） 4．800C烤4-6h，，使DNA牢固地吸附在膜上 DNA－