生物分离考研课件第8章亲和分离.ppt

第八章 亲和分离 8.1 生物亲和作用 8.2 亲和色谱 8.3 亲和膜分离 8.4 亲和错流过滤 8.5 亲和双水相萃取 8.6 亲和反胶团萃取· 8.7 亲和沉淀 8.1 生物亲和作用 1.亲和作用的本质 结构：钥匙和锁孔的关系 分子作用力： 静电作用 氢键 疏水性相互作用 配位键 弱共价键 能够影响以上作用力的因素都可影响生物分子间的亲和作用，如离子强度、pH、温度等。 2.亲和作用体系 亲和作用分子对中被固定的分子称为配基(ligand) 结合常数越大，亲和作用越强 合适 104～108L/mol 生物素(biotin)－亲和素(avidin) 1015L/mol 不可逆 8.2 亲和色谱 利用偶联有亲和配基的层析介质为固定相，根据生物分子之间的亲和作用进行物质分离的液相色谱方法。 很高选择性，可采用断通式前端分析法。 如选择性较低时，进料量远低于穿透所需进料量。 1. 亲和吸附介质 将亲和配基共价偶联到载体的表面即可制备亲和吸附介质。 常用层析介质并不能直接和亲和配基化学结合，一般先要进行活化或功能化，即要引入反应基团。 活化后的层析介质能够通过反应基团和亲和配基反应，从而制备出亲和层析介质。 载体要求： 具有亲水、多孔结构； 含有可活化的反应基团； 理化性质稳定，不因共价偶联反应的条件及吸附条件的变化而发生变化； 非特异吸附小。 多糖类的凝胶过滤介质表面含有大量可活化的羟基可作为亲和配基的载体。 表面具有氨基的聚丙烯酰胺类的载体也常作为亲和配基的载体。 还可采用一些无机载体如硅胶和多孔玻璃。 亲和配基要求： 配基与被分离生物大分子之间的专一性识别或特异性作用，必须是可逆的。 配基与被分离分子之间结合力要有足够高，以能形成稳定的复合物；同时结合又不能太强，否则洗脱困难。 固定到载体上后配基的专一性识别或特异性作用不发生明显的变化。 载体的活化与偶联 多糖类载体的活化与偶联 常用的方法有溴化氰法、三嗪法、高碘酸盐法、环氧化物法等 （a）溴化氰活化 活化多糖载体中最为常用的方法，其反应时间短，只需要几分钟至几十分钟。溴化氰是剧毒药品，活化操作必须在通风橱中进行。 适合于带有氨基的配基如蛋白质的偶联。 （b）三嗪法 均二氯三嗪或三氯三嗪（氰尿酰氯）可活化多羟基的介质。单氯三嗪基—多糖复合物，在pH7-9及0-20℃条件下，可和含有伯胺之类亲和配基偶联 。 （c）高碘酸盐法 高碘酸钠(NaIO4)可将多糖基质上相邻的连二醇基氧化成为醛基，醛基与氨基反应生成不稳定的Schiff碱，然后将Schiff碱还原。 （d）环氧化物法 常采用环氧氯丙烷和二羟基正丁烷双缩水甘油醚（BGE）做活化剂，活化后的载体可以直接与R－OH、 R－SH 、 R－NH2 偶联(直接法), 但反应速度慢，一般需要24h以上。 间接法：环氧基团进一步活化，然后偶联配基 聚丙烯酰胺载体的活化与偶联 （a）戊二醛法 （b）肼法 肼法特别适用于含有酰胺基载体的活化，在肼的作用下，酰胺基变成酰肼基，然后在亚硝酸的作用下生成叠氮化合物，最后与含氨基的配基偶联。 硅胶与多孔玻璃的活化与偶联 活化方式采用硅烷化试剂进行，如γ-环氧基丙氧基－三甲氧基硅烷、 γ-氨丙基三甲氧基硅烷。硅烷化试剂将环氧基团或氨基引入无机材料上，可进一步采用相应方法固定配基。 间隔臂 当配基的分子量较小的时候，如果将其直接固定到载体上，会由于空间位阻的影响，配基与生物大分子不能发生有效的结合。 这时需要在配基和载体之间引入一个间臂分子，使配基和生物大分子发生有效作用。 引入间臂分子最常用的方法: 先将间臂分子氨烷基化合物NH2(CH2)nCOOH、 NH2(CH2)n NH2连接到载体上。 然后将亲和配基连接在间臂分子上。 羧基和氨基在碳二亚胺的作用下可以缩合形成酰胺键。 间臂的长度是很重要的因素，太短，效果不明显；太长，间隔臂容易弯曲，结合效果会下降。 一般引入4－6个亚甲基时，间臂分子效果较好，常用的间臂分子为ω-氨基己酸、1，6-二