琐琐葡萄多糖对阿尔茨海默病模型大鼠行为学与形态学影响.docVIP

琐琐葡萄多糖对阿尔茨海默病模型大鼠行为学和形态学的影响 　　[摘要] 目的 探讨琐琐葡萄多糖（VTP）对Aβ25-35诱导的阿尔茨海默病（AD）模型大鼠学习记忆和海马神经元的影响。 方法 SPF级AD大鼠90只，随机分为正常对照组、模型组、阳性对照组（多奈哌齐组，0.5 mg/kg）、VTP低、中、高剂量组（300、150、50 mg/kg）。采用双侧海马CA1区注射Aβ25-35建立AD模型，随后给予等体积的药物和蒸馏水进行分组灌胃，持续15 d。利用Morris水迷宫观察大鼠行为学；在光镜和电镜下观察大鼠海马CA1区神经元形态变化；并用TUNEL染色检测大鼠海马神经元细胞凋亡水平。 结果 与AD模型组比较，VTP低、中、高剂量组和多奈哌齐组能明显改善大鼠学习记忆能力（P 　　1 对象与方法 1.1 实验动物 SD大鼠90只（清洁级），雄性，体重（250±20）g，鼠龄7～8周，由新疆医科大学动物中心提供（质量合格证号：NO.650007000） 1.2 试剂与仪器 VTP按照专利方法提取分离（专利号200710 201354）。Aβ25-35（Sigma公司，生理盐水溶解后置于37℃孵化7 d）；盐酸多奈哌齐片（卫材药业有限公司，批号：；TUNEL试剂盒，（瑞士罗氏公司，批号：11684817910）。脑立体定位仪（德国TSE Systems，型号：540060）；Morris水迷宫视频跟踪分析系统（成都泰盟科技有限公司）；三目显微镜（德国Leica公司，型号：DM3000B）；透射电子显微镜（日本JEOL公司，型号：JEM-1230） 1.3 实验方法 1.3.1 动物分组及干预 实验动物随机分为6组：正常对照组、模型组、阳性对照组（多奈哌齐组）、VTP高、中、低剂量组，每组15只，在SPF实验室正常饲养1周后建立模型。模型建立方法：3.0%戊巴比妥钠麻醉大鼠，定位海马CA1区钻孔，用微量进样器将10 μL（每侧5 μL，含10 μg）Aβ25-35溶液分别注入左右海马（正常对照组给予生理盐水），留针5 min。随后分组灌胃给药，每日1次（1.0 mL/100 g），连续15 d，为避免主观影响采取双盲方法。正常对照组和模型组大鼠给予蒸馏水灌胃；阳性对照组给予多奈哌齐溶液（多奈哌齐粉末溶于蒸馏水后充分震荡摇匀，0.5 mg/kg）进行灌胃；VTP高、中、低剂量组分别灌胃300、150、50 mg/kg 1.3.2 水迷宫实验 动物于给药第13天开始进行双盲水迷宫训练。定位航行实验（前6 d）：平台置于第3象限，大鼠从对象限入池，每次训练90 s，利用大鼠水迷宫系统自动记录所需的各项指标。第6天训练成绩作为测试结果。空间探索试验（第7天）：撤去平台，每只大鼠在原入池位置释放，记录其90 s内在原平台所在象限的游泳时间占总时间的百分比及其穿越有效区域位置（1.5倍原平台所在区域位置）的次数 1.3.3 石蜡切片制备及HE染色 每组随机抽取12只大鼠麻醉后进行灌注取脑，脑组织固定于4%多聚甲醛。制备石蜡切片（每个脑组织切片6张），常规HE染色（每个脑组织3张），光学显微镜下观察海马神经元形态结构变化，每组选取6张计数海马CA1区正常神经元数目 1.3.4 电镜标本制备及指标观察 每组随机抽取3只实验大鼠断头取脑，分离出海马组织，放置于电镜固定液中固定。进行脱水、包埋、切片常规处理后用电子显微镜观察海马神经元超微结构变化并采集图像 1.3.5 TUNEL细胞凋亡检测 按照罗氏TUNEL试剂盒的检测方法对大鼠脑组织石蜡切片标本（每个脑组织3张）进行细胞凋亡的检测，并利用光学显微镜对海马组织细胞形态进行观察并采集图像 1.4 统计学方法 采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；以P 　　本研究结果显示，模型组AD大鼠学习、记忆能力减退，海马神经元损伤严重，细胞调亡率显著增加，显示造模成功。与模型组比较，大鼠经过15 d的VTP或多奈哌齐治疗后进行水迷宫实验，在定位航行和空间探索实验中均发现空间学习记忆能力有明显的改善。脑组织海马神经元对空间记忆能力具有很重要的作用[20]，海马神经元的损伤可能是导致大鼠水迷宫实验逃逸潜伏期延长的原因。最新的研究表明，琐琐葡萄多糖对Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡具有抑制作用[21]，本实验在VTP和多奈哌齐治疗后，核固缩和凋亡神经细胞较模型组也明显减少，说明VTP能降低Aβ对AD大鼠的毒性作用 综上所述，海马CA1区神经元形态学改变及凋亡可能是导致AD大鼠学习记忆障碍的重要原因之一。VTP对Aβ诱导