表面聚合物提取.docVIP

A.o表面聚合物的提取 一、溶液配制 1. 30% (w/v)Acrylamide: Acrylamide 290g BIS 10g，加入600mL去离子水溶解，再定容至1L，用0.45um滤膜滤去杂质，与棕色瓶保存。（Acrylamide具有很强的神经毒性，可通过皮肤吸收，其作用有积累性，聚丙烯酰胺无毒。） 2. 10% (w/v)过硫酸铵APS：APS 1g，加入10mL去离子水溶解后贮于4度。（可在4度保存时使用2周左右，超过期限会失去催化作用。） 3. 1 mol/L pH 8.8/6.8 Tris-HCI缓冲液：准确称取Tris 12.1g，将其溶于蒸馏水中，用浓HCl调至pH=8.8/6.8，然后用蒸馏水定容至100 mL。 4. 5M LiCl溶液：称取Tris1.21g溶解于900mL三蒸水中，用浓盐酸调pH值至7.4，然后定容至1L，121℃高压灭菌，即为10 mM Tris-HCl(pH=7.4)溶液；然后称取LiCl 214.09g，用10 mM Tris-HCl溶解定容至100mL，即5M的LiCl溶液，抽滤除菌后于4℃冰箱中保存。 5. 12 mM DTT溶液：准确称取Tris 2.42 g并溶解于900mL三蒸水中，用浓盐酸调pH值至7.4，然后定容至1L，既为Tris-HCl(20mM pH=7.4)溶液，高压灭菌后备用；称取1.87g DTT溶解于pH7.4 Tris-HCl溶液中，既为所需溶液，经抽滤除菌后于-20℃冰箱中保存备用。 6. SDS-巯基乙醇-尿素PBS液：准确称取Na2HPO4·12H2O 1.14g、NaH2PO4·2H2O 1.08g配制0.1M pH=6.5的PBS溶液；然后再称取尿素48.29g、SDS 1.00g，量取巯基乙醇1mL，用PBS溶解并定容至100mL。抽滤除菌后4℃冰箱中保存备用。 7. 1.5%（w/v）SDS和0.1M NaOH溶液：分别按照标准方法配制10%的SDS溶液和0.1M NaOH溶液，然后再将10%的SDS溶液稀释至1.5%，分别抽滤除菌后常温放置备用。 二、A.o表面聚合物的提取 1．菌丝收集：用灭菌滤纸过滤，收集其中的捕食器菌丝及普通营养菌丝，然后用pH7.0的灭菌磷酸缓冲液洗涤3次，4℃放置备用。 2. 提取： （1）首先分别称取湿重为2.0g的捕食器菌丝或普通营养菌丝样品放入50mL三角瓶中； （2）然后在上述三角瓶中，分别加入10mL不同的提取液，中间不断搅拌； （3）4℃5000rpm离心20min，分离菌丝和抽提液。 （4）再重复4℃5000 rpm离心20min，将两次抽提液合并后于4℃放置，以备透析之用。 三、 A.o表面聚合物的透析与浓缩 1. 透析：透析袋的预处理商品透析袋出厂时都经10％的甘油处理过，并含有极微量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质，它们对蛋白质和其它生物活性物质有害，用前必须除去，可用以下方法处理： 双手戴手套，将44mm商品透析袋剪成10cm长度的小段，放于大体积的2%(W/V)碳酸氢钠和1mmol/L EDTA（pH8.0）溶液中煮沸15min；然后更换为适量蒸馏水继续煮沸5min，室温自然冷却后保存于4℃冰箱，注意必须确保透析袋始终浸没在溶液内。从此时起取用透析袋时必须戴手套。用前将透析袋内装满水，轻轻挤压不漏液后将水排出，并用灭菌蒸馏水冲洗内外壁3遍后备用。表面聚合物的透析取洗净备用的透析袋，一端用橡皮筋或线绳扎紧（也可以使用特制的透析袋夹夹紧），装入上述表面聚合物的提取液，通常要留三分之一至一半的空间，以防透析过程中，透析的物质量较大时，袋外的水和缓冲液过量进入袋内将袋涨破，然后向袋内放一截两头园钝的玻璃棒，以使透析袋沉入液面以下，再将另一端扎紧，放入透析容器内，加入适量10 mM Tris-HCL(pH=7.4)透析液后于4℃透析过夜。使用含盐量很高的蛋白质溶液透析过夜时，体积增加50％是正常的。为了加快透析速度，透析的容器要尽量大一些，可以使用大烧杯或者大量筒，除多次更换透析液外，同时还可使用磁力搅拌器搅拌。 2. 表面聚合物的浓缩与保存： 4℃下透析过夜样品，倒掉袋外的水，然后向其中加入PEG-20000进行浓缩，中间视具体情况添加PEG-20000，将溶液浓缩至原体积的1/10后，取出透析袋用灭菌蒸馏水冲洗袋壁，将浓缩液转入灭菌离心管中。将浓缩后的溶液4℃，900g离心10min，吸取上清液，按每管0.5mL分装至灭菌离心管中，加入终浓度为5%的二甲基亚砜，如果下游试验不检测蛋白质酶的活性，则加入蛋白酶抑制剂(100 mM PMSF乙醇溶液，10μL/mL剂量；6mg/mL抑胰凝乳蛋白酶素DMSO溶液，2μ