插入片段PCR验证.pdfVIP

分子生物学实验 利用PCR 扩增验证目的基因片段 郭森 200900140029 基地第4 组（同组：付伟伟、葛纪弯） 生命科学学院 2009 级生命技术基地 分子生物学实验——利用PCR 扩增验证目的基因片段 一、实验目的 1、掌握PCR 法扩增目的基因片段的基本原理与方法； 2、通过PCR 验证目的基因片段是否插入质粒中； 3、充分理解本学期三次分子实验的原理、联系与意义。 二、实验原理 1、PCR 技术基本原理 PCR （Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA 聚合酶催化下，以 母链DNA 为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母 链模板DNA 互补的子链DNA 的过程。是一项DNA 体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩 增一定长度的DNA 片段。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究 等许多方面。 在高温（94℃）下，待扩增的靶DNA 双链受热变性成为两条单链DNA 模板；而后在低温 （37～55℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA 模板结合，形成部分 双链；在普通Taq 酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以d NTP 为原料， 沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA 新链。这样，每一双链的DNA 模板，经过一次解链、 退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA 分子。如此反复进行，每一次循环所产 生的DNA 均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA 特异区 n 拷贝数扩增一倍，PCR 产物得以2 的形式迅速扩增，经过25～30 个循环后，理论上可使基 因扩增10 倍以上。 2、利用PCR 扩增验证目的基因片段 本实验的目的是验证目的基因片段是否插入 pUC19 质粒中并对比插入的是否为预期目 的基因片段。首先，根据上次实验的酶切结果，可以初步得知本组目的基因片段是否插入 pUC19 质粒及插入片段的大小；然后，因为目的基因片段插入到了酶切后的pUC19 质粒中， 也就是插入到了其多克隆位点（MCS）中，所以使用多克隆位点的上下游引物就可以把包括 目的基因片段在内的多克隆位点扩增出来；最后，若目的基因片段插入到了pUC19 质粒中， 则扩增之后使用琼脂糖凝胶电泳就可以通过比对Marker 来分析pUC19 质粒中是否插入了目 的基因片段。 三、实验材料 1、试剂 Taq DNA polymerase、10*PCR buffer、MgCl 、d NTP、ddH O、10*loading buffer、TAE 2 2 山东大学生命科学学院 第1 页 分子生物学实验——利用PCR 扩增验证目的基因片段 buffer、琼脂糖、DL2000 plus marker、引物混合物、插入目的基因的pUC19 （模板）; 2、仪器 薄壁PCR 管，PCR 扩增仪，微量移液器，量筒，微波炉，电泳仪，制胶槽，电泳槽，凝 胶成像检测仪，梳子，手套。 四、实验步骤 1、稀释模板 我们将本组要进行PCR 扩增的质粒模板进行了20 倍稀释（取1ul 质粒加19ul ddH2O）。 2、PCR 体系的配制 根据本组重组质粒的酶切结果可知，我们质粒中插入的目的基因片段的大小大约为 2.3kb 左右，我们又使用了老师提供的两种模板，插入的目的基因片段大小分别为125bp 和 564bp。因此，本组进行PCR 扩增的模板共有三组，插入片段大小按照点样顺序分别为：125bp、 564bp 和2.3kb。 我们先将除模板之外的三组体系一起配好，按照表1，将所列试剂依次加入PCR 管中， 然后分别加入模板，放入PCR 仪内。 表1 PCR 反应各组分及其体积 PCR 组分 体积/ul ddH O