第15章流式细胞仪分析技术及应用.pptVIP

细胞介导细胞毒性试验(死细胞与活细胞比例) 细胞内细胞因子测定 二、淋巴细胞功能分析 三、淋巴造血系统及白血病免疫分型 对淋巴瘤和白血病进行多色免疫分型 用于选择化疗方案、判断预后及检出微小残留病变 CD4+Th细胞、CD4+/CD8+比例 MDR(+)表示对化疗药物耐药 四、肿瘤耐药基因分析 五、AIDS病检测中的应用 HLA-B27可出现在58%～97%的强直性脊椎炎(As) 患者 六、自身免疫病相关HLA抗原分析 FCM作为一个强大的技术平台，已应用于多个领域，其在移植免疫分析中的应用也越来越广泛。目前移植免疫中的FCM应用主要包括流式细胞术的交叉配型（Flow cytometry cross-matching, FCXM）和群体反应性抗体（Panel reactive antibody, PRA）检测。 七、移植免疫中的应用 小 结 流式细胞术（FCM）是在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，从分子水平上获取多种信号实现对单个细胞进行定量分析或纯化分选。 FCM分析中前向散射光反映颗粒的大小；侧向散射光反映颗粒内部结构复杂程度、表面的光滑程度；荧光反映颗粒被染上荧光部分数量的多少，根据其标记的抗原分子不同，即反映了不同抗原分子的表达情况。 同型对照为免疫荧光标记中的阴性对照，可使荧光标记单抗的信号保持其特异性。 对各项工作环节和仪器性能进行严格的质量控制和规范化操作，是保证FCM分析中各项检测数据和指标可靠性的关键 思考题 流式细胞仪的分析检测原理是什么？ 流式细胞仪分析中前向散射光、侧向散射光和荧光的检测意义。 何谓荧光补偿？何谓“液相芯片”技术？ 细胞分选的基本原理。 FCM分析中有哪些数据显示方式，如何解读结果及其设门分析的意义？ 如何进行FCM分析检测样品的制备？ 流式细胞分析前如何验证仪器工作状态，采用何种校正物？ 流式细胞免疫分析的质量控制包括哪些方面？ 流式细胞术有哪些临床应用价值？ 流式细胞仪分析中常见的荧光素有那些？他们的特性如何？ * 由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。 （一）单参数直方图 单参数直方图 细胞相对数量 信道(channel) 双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。 （二）双参数散点图 X轴反映SS的信号强弱 Y轴反映FS的信号强弱 X轴反映FITC荧光信号强弱 Y轴反映PE荧光信号强弱 每个点代表一个细胞 1. 点图 2. 二维等高图 由类似地图上的等高线组成 等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等高”。 曲线层次越高(越里面的线) 所代表的细胞数愈多。 等高线越密集则表示细胞数变化率越大。 二维等高图 3. 假三维等高图 （三）三参数直方图 多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。 （四）流式细胞仪的多参数分析 指同一张单参数或双参数直方图中根据信号的强弱来划定分析区域，从而计算分析区域内的细胞数量。 Gate设置 1 Region设置 2 指在某一张选定参数的直方图上根据该图的细胞群分布选定要分析的特定细胞群，并要求该样本的所有其他参数组合的直方图只体现该群细胞的分布情况。 五、设门分析技术 A 淋巴细胞 B 单核细胞 C 中性粒细胞 A、B、C均为任意门 线性门 D1 CD4+/CD3- D2 CD4+/CD3+ D3 CD4- /CD3- D4 CD4- /CD3+ 如十字门分析时，起就可以由四个区域构成，即G=D1+D2+D3+D4。 样本制备 标记染色 液相芯片技术 质量控制 第四节 流式细胞仪免疫分析的技术要求 外周血淋巴细胞样品的制备 分离单个核细胞 培养细胞的样品制备 蛋白酶消化 机械吹打 使贴壁细胞脱落 洗涤 尼龙网过滤 单细胞悬液 一、免疫检测样品制备 新鲜实体组织单细胞悬液的制备 机械法 酶处理法 化学试剂处理法 表面活性剂处理法 单细胞悬液的保存 深低温保存法（一年） 乙醇或甲醇保存法（2周） 甲醛或多聚甲醛保存法（2月） 适用条件: 有较高的量子产额和消光系数 对488nm的激发光波长有较强的吸收 发射光波长与激发光波长间有较大的波长差 易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性 二、常用的荧光染料与标记染色 FITC Texas red PE.PC.APC PEcy5 FL1 FL2 FL3 FL4 激光 细胞悬液 异硫氰酸荧光素 得州红 能量传递复合染料 藻胆蛋白类 （一）几种常见的荧光染料 名称 染料 激发波长 荧光颜色 溶解性 对P