第一章生物大分子物质的制备.pptVIP

三、化学处理 脂溶性的溶剂可把细胞壁、细胞膜的结构部分溶解 四、生物酶降解 生物酶(如溶菌酶)有降解细菌细胞壁的功能。 在用此法处理细菌细胞时，先是细胞壁消解，随之而来的是因渗透压差引起的细胞膜破裂，最后导致细胞完全破碎。 第四节 抽 提 一、抽提的含义 抽提通常是指用适当的溶剂和方法，从原料中把有效成分分离出来的过程。 经过处理和破细胞原材料中的有效成分可用 缓冲液、稀酸、稀碱、或有机溶剂(如丙酮、乙醇)等抽提；还可用蒸馏水抽提。 一般理想的抽提溶液应具备下述条件： 对有效成分溶解度大，破坏作用小； 对杂质不溶解或溶解度很小； 来源广泛、价格低廉、操作安全等。 二、抽提有效成分的影响因子 抽提时 pH值、金属离子、溶剂的浓度、极性等因子， 可明显影响有效成分的性质和数量。 1 pH值 对蛋白质或酶等具有等电点的两性电解质物质，一般选择抽提液的pH值应在偏离等电点的稳定范围内。 通常： 抽提碱性蛋白质选用低pH值的溶液； 抽提酸性蛋白质选用高pH值的溶液； 或者用调至一定pH值的有机溶剂。 2 溶剂的极性和离子强度 有些蛋白质或酶在极性大、离子强度高的溶液中稳定；有些则在极性小、离子强度低的溶液中稳定。 （1）通常降低极性的方法 在水溶液中增加蔗糖或甘油的浓度。 若用二甲基亚砜(DMSO)或二甲基甲酰胺代替蔗糖或甘油时，会使溶液的极性大大降低。 （2）离子强度等于溶液中各离子浓度（C）与离子电荷数（Z）平方乘积总和的二分之一。 在水溶液中加人中性盐如KCl、NaCl、NH4Cl和(NH4)2SO4能提高溶液的离子强度。 一般来说： 离子强度较低的中性盐溶液有促进蛋白质溶解，保护 蛋白质活性的作用； 离子强度过高则会引起蛋白质发生盐析作用。 3 水解酶 在抽提、纯化蛋白质或核酸时，其效果常常受到本身存在的水解酶的影响。 这些酶在与欲抽提的蛋白质或核酸接触时，一旦条件适宜，就会发生反应，导致蛋白质或核酸分解，而使实验失败。 防止方法（目的是使这些酶丧失活性 ）： ①加入抑制剂(苯甲基磺酰氟化物，PMSF，见表1-1、1-2)， ②调节抽提液的pH、离子浓度或极性等方法， 4 温度 一般认为蛋白质或酶制品在低温(如0℃左右)时最稳定。 但有些物质对温度的要求却与此不同。 例如： 从鸟肝分离出的丙酮酸羧化酶对低温敏感，25℃时才稳定。 有机磷农药水解酶，置-10 ℃时会快速失活，移至21℃时两天后开始失活，此后每天失活剩余酶的16％。若将其存放在6℃时失活速度较缓慢，每天约丧失活力0.75％。 5 搅拌 搅拌可促使欲抽提物与抽提液之间相互接触，并能增加溶解度。 但是，一般宜采用温和的搅拌方法，速度太快时容易产生泡沫，导致某些酶类变性失活。 6 氧化 存在氧化剂或氧分子时，会使巯基形成分子内或分子间的二硫键，导致酶(或蛋白质)失活(或变性)。 在抽提液中加入还原剂时，就可以防止巯基发生氧化作用，或者延缓某些酶活性的丧失。 在有些植物组织或微生物细胞中含有较多的酚类化合物，加入还原剂可防止褐化。 7 金属离子 蛋白质的巯基能和金属离子如铅、铁或铜作用，产生沉淀复合物。这些金属离子主要来源于制备缓冲液的试剂中。 解决的办法: ①用无离子水或重蒸水配制试剂； ②在配制的试剂中加入1-3mmol／L EDTA(金属离子络合剂)。 8 抽提液与抽提物的比例 在抽提时，抽提液与抽提物的比例一般以5︰1为宜。如抽提液过多，则有利于有效成分的提取，但不利于纯化工序的进行。 否则反之。 第五节 浓 缩 一般抽提液的体积都比较大，应先进行浓缩处理。 常用的浓缩方法有下面几种: 沉淀法 吸附法 超过滤法 透析法 减压蒸馏法 冰冻干燥法 一、沉淀法 在抽提液中加入适量的中性盐[如 (NH4)2S04]或有机溶剂，使有效成分变为沉淀(见第二章)。 经离心分离，获得有效成分。 二、吸附法 将干葡聚糖凝胶G25(或吸水棒)加入抽提液中，两者比例为1︰5。 由于凝胶吸水之故，抽提液的体积可缩小三倍左右，回收蛋白质量约80％。 三、超过滤法 把抽提液装入超过滤装置(见图1-1)，在空气或氮气(5.05×105Pa)压力下，使小分子物质(包括水分)通过半透膜(如硝酸纤维素膜)，大分子物质留在膜