第3章3蛋白质变性与复性.pptVIP

第二节 蛋白质变性与复性Unfolding and Refolding 变性与复性 变性与复性 蛋白质结构蛋白质的结构层次 促进与维系蛋白质折叠和天然构象的作用力 促进与维系蛋白质折叠和天然构象的作用力 包涵体 包涵体对分离纯化的影响 包涵体的分离 包涵体的溶解 包涵体的溶解 蛋白质的复性 蛋白质的复性 蛋白质的复性 蛋白质的复性 稀释复性法 ②机械破碎——膜分离除可溶性蛋白——变性剂溶解包含体——除变性剂复性； 路线②应用膜分离技术，用微孔膜除去可溶性蛋白质，但细胞碎片和包含体一起被膜挡住，难以分开；而且膜的堵塞和浓差极化常常导致可溶性蛋白质的滞留。优点：封闭式操作，不污染环境也不受环境污染，能量消耗也比离心法少。 ③化学破碎(加变性剂)——离心除细胞碎片——除变性剂复性。 路线③是用化学法破菌，所采用的试剂既可以破菌又可以溶解包含体，将两道工序合为一道，节省了设备和时间。缺点：所有的可溶性杂质都没有被除去，混杂在产物中间，给后分离带来困难。 稀释复性法 稀释复性法 稀释复性法 蛋白质复性时聚集反应的抑制 蛋白质复性时聚集反应的抑制 蛋白质复性时聚集反应的抑制 稀释法复性的缺点与改进的方案 改进的方案： 膜透析复性 反胶束复性 固相辅助复性 透析复性法 色谱复性法 凝胶过滤复性 亲合色谱复性 亲合色谱复性 亲合色谱复性 亲合色谱复性 离子交换色谱复性 各种色谱复性方法的比较 各种色谱复性方法的比较 提高复性率的策略 1、二硫键的形成 拥有多重二硫键的蛋白，需要更复杂的再折叠过程，要求氧化剂和还原剂都在最佳的浓度下，以便于二硫键的形成。 2、小分子添加物 降低蛋白聚集的策略是使用小分子添加剂，如丙酮、乙酰、尿素、去污剂、蔗糖、短链醇、DMSO和PEG等。最常用的是Ｌ－精氨酸、低浓度（1-2M）尿素或盐酸胍以及去污剂（SDS）。 提高复性率的策略 3、模拟体内蛋白折叠过程 在细胞内，内源肽链的折叠和聚集过程受分子伴侣和折叠酶的调节，因此，共表达分子伴侣或折叠酶可提高外源蛋白的可溶性表达。 4、温和溶解工艺相结合提高复性率 为减少蛋白质聚集，应采用一种适宜的再折叠过程，使中间体不变成有聚集倾向的结构，比如，疏水性基团不完全暴露。 凝胶过滤色谱是以溶液中分子的流体力学体积大小进行混合物分离的技术。物料在色谱柱中的保留体积不会超出色谱柱中的溶剂的总体积，保留时间短，溶质峰相对较窄，容易检出，灵敏度高。能够把握间隔进料的时间，进行色谱柱的连续使用，提高使用效率。 蛋白质分子大，先从柱子上洗脱，变性剂分子小，最后流出色谱柱。达到复性目的。 原理：是利用配体与目标蛋白质之间的特异亲合作用，使变性蛋白质分子保留在柱的顶端与变性剂分离，而后在洗脱过程中进行复性。 依使用的配体，用于复性的亲合色谱有： 抗体亲合色谱、金属亲合色谱(IMAC)、 脂质体亲合色谱和分子伴侣亲合色谱等。 以金属离子为配体的亲合色谱复性法 如以Ni2+为亲合配体，可与末端标记有组氨酸的蛋白质分子有特异的亲合作用，而这种作用又不受强变性剂的影响，可用于重组蛋白质的复性。 脂质体亲合色谱复性 脂质体作为配体用于蛋白质复性的原理是：局部变形的蛋白质分子结构类似于融球状态，与具有天然蛋白质相似的二级结构，此时，蛋白质分子仍然具有强的疏水表面，可同脂质体的脂质双层作用，以帮助蛋白质进行复性。 分子伴侣亲合色谱，又称为“折叠色谱”。为变性蛋白质提供一个中空环状的疏水腔，当变性蛋白质进入空腔后，可部分避免或完全消除变性蛋白质分子间的聚集作用，使蛋白质在疏水环境中进行“结合-释放-再结合”的循环过程，直到恢复其天然的构象状态。 原理：变性蛋白质、变性剂及变性液中的其他组分与离子交换介质间的电荷作用，使它们吸附在离子交换固定相表面，由于这些组分与离子交换介质的吸附能力的差别，在洗脱过程中进行不断地吸附-解吸-再吸附的过程，使变性蛋白质与变性剂逐渐分离，并在吸附-解吸的过程中进行复性过程。 凝胶过滤色谱(SEC)复性法：复性分离过程中，变性蛋白质分子逐渐变小，柱负荷小，产物浓度低，复性分离时间长，效率较低。 离子交换色谱(IEC)复性法：柱负荷大，分离效果尚好，最常用的变性剂盐酸胍在柱保留，影响柱容量，且往往与蛋白质一起洗脱，使盐酸胍的使用受到限制。 亲合色谱(AFC)复性法：因蛋白质与介质有特异的相互作用，变性蛋白质分子间聚集反应少，使原不可逆折叠的蛋白质变成可逆。但使用范围窄，分子伴侣昂贵，时间长。 色谱复性方法的问题： 在复性过