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菌种管理规程 目 的范围 种的管理，包括菌种的保存传代、使用及负责菌种的保存传代及相关术语0代。 相关文件程 序.1标准菌种的复苏、确认、传代 3.1.1 标准菌种的复苏步骤如下： 把冻干菌种管、灭菌毛细滴管（1ml）、双碟、镊子、营养肉汤培养基（或其它适宜培养基）数支，移入接种室或超净工作台。 将冻干菌种管外壁用碘酒擦洗消毒，稍干，用75%乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将标准菌种管的封口一端在火焰上，烧灼红热，用灭菌毛细滴管吸取营养肉汤培养基（或其它适宜的培养基），滴在灼热的菌种管封口一端，使骤冷而炸裂。 取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，另取1支灭菌毛细滴管，在火焰旁吸取营养肉汤培养基（或其它适宜的培养基）少许，加至菌种管底部，将冻干菌块搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，接种至营养肉汤培养基（或其它适宜的培养基）内，并根据不同菌种类型而将其培养于相宜的温度下24～72h（细菌需要 24～48h的培养物，酵母菌需要72h的培养物，形成孢子的微生物则宜保藏孢子）。最后将毛细滴管及菌种管经高温灭菌（121℃，30分钟）。黑曲霉的菌悬液先室温待菌悬液融化后用无菌吸管吸取管内液体1～2滴滴在改良马丁琼脂斜面上，用吸管涂布均匀，置23～28℃培养5～7天，斜面正面为黑褐色厚绒状，色泽均一，不应有杂色，斜面侧面无色，接近菌层培养基略带黄色。确认后用含有0.05%（ml/ml）的吐温-80的0.9%无菌氯化钠溶液洗脱到无菌试管中。 取经复苏后的上述细菌菌液8-10ml至100ml4.4.2项下液体培养基中按g项操作对菌种进行复壮。以无菌技术向复壮后的菌种中加入100ml20%的无菌甘油混匀，1-2ml/管分装于冻存管。每个菌种制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认。其余作为储备管。黑曲霉的h项下洗脱液按h项下方法进行复壮，制成复壮后的孢子悬液20ml。以无菌技术向复壮后的菌种中加入20ml30%的无菌甘油混匀，1-2ml/管封存于冻存管。制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认。其余作为储备管。将上述制备好的冻存管逐支粘贴标签。内容包括：菌种名称、菌种代号、编号、代次、制备日期、制备人、贮存条件、有效期至等。 储备菌种管制备成功，储存于－20℃，有效期为三年。 取出培养物，仔细观察液体培养基是否浑浊，浑浊说明菌种复活生长，若不浑浊，在将其作为无活菌生长的培养物丢弃以前，细菌应至少培养1周以上，真菌和酵母菌至少应培养2周以上，并在丢弃之前应高温灭活处理（121℃，30分钟）。 3.1.2 标准菌种的确认 用无菌接种环取上述培养物接种到营养琼脂培养基（细菌）或玫瑰红钠培养基（真菌和酵母菌）平板上，或相应的宜于该菌生长的鉴别培养基平板上，然后在30～35℃下培养1～3天（细菌）；23～28℃下培养5天（真菌和酵母菌）。培养后，首先观察其是否具有典型的菌落形态，然后挑取生长旺盛的单一的纯菌落，划线于平皿培养基，每种菌划4个平皿，以便收集较多的生长旺盛的典型单菌落，进行保存和鉴定。鉴定时作革兰氏染色、镜检，观察其染色特性及形态特征。最后再做生化实验以进一步鉴定该菌种。 若在该平板上发现有其它菌落生长，则说明操作有污染或菌种不纯，应将此被污染了的培养物灭活处理，并寻找原因。应根据其原因采取措施重新分离挑选纯菌落。 上述操作完成后，需填写《菌种传代、分离、鉴定记录》。 各菌种的复活、划线用培养基、培养条件，见《菌种复活、划线用培养基、培养条件》（附件2）。 3.1.3 标准菌种的传代和保藏 按菌种说明书要求复溶菌粉，转种于适宜的增菌培养基内，称第1代（G1），复壮后转接至平板上，并在适当温度下培养适当时间，分离单个纯种菌落，此为第2代（G2）。 菌种确认后，挑取平板上纯菌落制成浓菌悬液用于制备甘油冷冻管，作为传代用菌种（G2），同时挑取纯菌落转接斜面菌种数支，作为工作用菌种，此为第3代（W3）。 将第2代（G2）菌种管冷冻保存，将工作用菌（W3）于适当温度下培养适当时间后用于日常检验。 3.2 传代用菌种的传代和保藏 3.2.1当无标准用菌种时，可从省（市）药检所购买菌种作为传代用菌种，不需经过复溶增菌，但应划线接种确认。 3.2.2将购回无异常的传代用菌种（一般为第3代），根据日常检验工作的需要量，挑取纯菌落转接斜面菌种数支，作为工作用菌种(为第4代)，同时，结合菌种的代数和最长保存期限，挑取纯菌落制成浓菌悬液制备甘油冷冻管或液体石蜡管数支，作为传代用菌种（仍为第3代）。 3.2.3传代用菌的传代其操作步骤如下（斜面接种法）： 从冰箱冷藏室中取出菌种斜面后，应在室温放置约30分钟。 将装有新鲜配制的培养基菌种保藏管管壁上注明菌名及