用软件设计引物(Primer Premier amp; Oligo).pdfVIP

用软件设计引物（Primer Premier Oligo ） 使用不合适的PCR 引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带 很弱，等等。现在 PCR 引物设计大都通过计算机软件进行，软件的立足点也是按照引物设计的基本原则，只是更加快 速和自动化而已。我们可以直接提交模板序列到特定网页，如著名的primer3 （/ ），得到设计好的引 物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。一般来说，专门进行PCR 引物设计的专业软件功能更为强大，但使 用起来却不太容易。 软件的引物设计功能主要体现在两个方面：首先是引物分析评价功能，该功能只有少数商业版软件能够做到，其中以 “Oligo 6”最优秀；其次是引物的自动搜索功能，各种软件在这方面的侧重点不同，因此自动搜索的结果也不尽相同。据 笔者的经验，自动搜索功能以“Premier Primer”为最强且方便使用，“Oligo 6”其次，其他软件如“Vector NTI Suit”、“DNAsis” 、 “Omiga”和“Dnastar”都带有引物自动搜索功能，但搜索结果不是十分理想。要想得到效果很好的引物，在自动搜索的基 础上还要辅以人工分析。笔者认为引物设计软件的最佳搭配是“Oligo”和“Premier”软件合并使用，以“Premier”进行自动搜 索，“Oligo”进行分析评价，如此可快速设计出成功率很高的引物。 Primer Premier 5.0 的使用技巧简介 1. 功能 “Premier” 的主要功能分四大块，其中有三种功能比较常用，即引物设计、限制性内切酶位点分析和DNA 基元(motif)查 找。“Premier”还具有同源性分析功能，但并非其特长，在此略过。此外，该软件还有一些特殊功能，其中最重要的是设 计简并引物，另外还有序列“ 朗读”、DNA 与蛋白序列的互换、语音提示键盘输入等等。 有时需要根据一段氨基酸序列反推到DNA 来设计引物，由于大多数氨基酸（20 种常见结构氨基酸中的18 种）的遗传 密码不只一种，因此，由氨基酸序列反推DNA 序列时，会遇到部分碱基的不确定性。这样设计并合成的引物实际上是 多个序列的混和物，它们的序列组成大部分相同，但在某些位点有所变化，称之为简并引物。遗传密码规则因物种或细 胞亚结构的不同而异，比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不一样的。“Premier”可以针对模板DNA 的来源以相应的 遗传密码规则转换 DNA 和氨基酸序列。软件共给出八种生物亚结构的不同遗传密码规则供用户选择，有纤毛虫大核 （Ciliate Macronuclear ）、无脊椎动物线粒体（Invertebrate Mitochondrion ）、支原体（Mycoplasma ）、植物线粒体（Plant 、脊椎动物线粒体（Vertebrate Mitochondrion ）、原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion ）、一般标准（Standard ） Mitochondrion ）和酵母线粒体（Yeast Mitochondrion ）。 2. 使用步骤及技巧 其主要功能在主界面上一目了然。限制性酶切点分析及基元查找功能比较简单，点击该功能按钮后，选择相应的限制性 内切酶或基元（如-10 序列，-35 序列等），按确定即可。常见的限制性内切酶和基元一般都可以找到。你还可以编辑或 者添加新限制性内切酶或基元。 进行引物设计时，打开DNA 序列后点击按钮primer ，出现“search criteria”窗口，有多种参数可以调整。搜索目的（Seach For ）有三种选项，PCR 引物（PCR Primers ），测序引物（Sequencing Primers ），杂交探针（Hybridization Probes ）。搜索 类型(Search Type)可选择分别或同时查找上、下游引物（Sense/Anti-sense Primer，或Both ），或者成对查找（Pairs ），或 者分别以适合上、下游引物为主（Compatible with Sense/Anti-sense Primer ）。另外还可改变选择区域（Search Ranges）， 引物长度（Primer Length ），选择方式（Search Mode），参数选择（Search