第四部分分子微生物学实验方法.PDF

第四部分 分子微生物学实验方法 基因重组可通过转化、转导、接合、溶原性转换等方式。本章所选的细菌耐药基因的重 组实验属转化和接合的范畴。 分子诊断是一门新兴的生物科学技术，它已被广泛的应用于生命科学的各领域。其主要 方法可分为检测核酸和检测蛋白质二大类。本章主要介绍几种最常用的分子诊断方法。分子 诊断技术最大的优点在于灵敏度高、特异性强，并适于快速诊断。 实验二十 细菌耐药基因的重组 一、细菌质粒的提取与转化 细菌的后代具有与亲代相同的特征，这是由细菌的遗传物质染色体 DNA所决定的。但有 些遗传特性是由染色体外的遗传物质——质粒所编码的，如抗药基因即可在于质粒上。这种 特性可以通过质粒的传递，在同种或种属关系相近的细菌间转移，使细菌产生耐药特性。 细菌质粒 DNA 的提取的二种方法——煮沸裂解法与碱裂解法，分别介绍如下： 以煮沸裂法提取耐氨苄青霉素供体菌 E .coli 1371(Ampr) 的质粒DNA,并以CaCl 处理对氨 2 苄青霉素敏感的受体菌 E .coli YMC-15(AmpS)制备感受细胞，在 42℃短暂作用下，可提高接 受外源 DNA 的效率，从而使对氨苄青霉素敏感的受体菌E .coli YMC-15 转化为耐对氨苄青 霉素的耐药菌。 【材料】 (一) 菌种： 供体菌 E .coli 1371，含Ampr 质粒 受体菌 E .coli YMC-15 (二) LB 培养基： 1％蛋白胨，0.5 ％酵母浸出液，0.5 ％NaCl (三) 悬浮液：25 ％蔗糖，50 mmol/L Tris-HCl，pH8.0 ( 四) 裂解液：50 mmol Tris-HCI，pH8.0 5 ％蔗糖，50 mmol/L EDTA，5 ％Triton-100 (五) 溶菌酶液： 5-10 mg/ml，用前配制 (六) 3 mol/L NaAc (七) DNA 保存液 10 mol/L Tris-HCI，pH8.0 ，1 mmol/L EDTA 78 (八) 50 mmol/L CaCl2 (九) 50 mmol/L CaCl2 ，15％甘油 (十) 氨苄青霉素(Amp) 5 mg/ml 【方法】 (一) 耐药质粒的提取 A 、热裂法提取耐药质粒DNA 1．将供体菌接种入5 ml 含 Amp 的LB 培养基中，37 ℃摇床过夜，使细菌生长繁殖。 2 ．将菌液离心，4000 rpm 离心 5min，沉淀菌体。 3 ．弃上清，菌体沉淀物加入悬液，使菌体充分悬浮。 4 ．加入裂解液及溶菌酶，混匀。此时菌体细胞壁上应出现小孔。 5 ．置沸水浴中加热2 min ，然后迅速置冰溶中冷却 5 min 。使细菌染色体DNA 与残留 细胞壁形成团块，而质粒因分子量低，可自细菌壁上小孔漏出于上清液中。 6 ．取上清，加入 1/10 体积 NaAc 及 2 倍体积冷无水乙醇，以沉淀质粒 DNA 。 7 ．离心，1000 r/min，弃上清，倒置吸干水份，沉淀物置干燥缸内抽滤 8-10 min。加入 DNA 保存液使之溶解，即得到质粒 DNA ，用琼脂糖电泳，溴化乙啶染色，可见残留的细菌 染色体、RNA 及质粒条带(在紫外线下) 。 B 、碱裂解法提取耐药质粒DNA 【材料】 （1）含质粒的大肠杆菌 1.2ml/支×3 （2 ）P1 （含RNA 酶 100ug/ul） 0.5ml/支×1 （3 ）P2 0.5ml/支×1 （4 ）P3 0.5ml/支×1 （5 ）酚（Tris 饱和） 1ml/支×1 （6 ）氯仿－异戊醇