血红蛋白和核黄素的凝胶.pptx

;实验目的;主要内容;什么是层析技术;层析技术的原理;层析技术的分类;血红蛋白与核黄素;凝胶层析的原理;;凝胶层析的介质;柱层析的基本装置;柱层析的预备;实验器材与试剂;实验操作;2. 装柱? 取直径0.8~1.2 cm长25~30 cm的层析柱一支，将层析柱出口接上乳胶管，在柱底部填入一薄层玻璃棉或海绵垫。关住层析柱出口，用细玻璃棒将凝胶颗粒搅成悬液，顺玻璃棒缓缓倒入层析柱中。当凝胶颗粒沉积约2 cm高时，打开出口，使缓冲液缓缓流出，同时继续倒入凝胶悬液，掌握倒入速度，使其与缓冲液流出速度大体相同，直至凝胶床高度达18cm时为止。关闭层析柱出口，要求凝胶床要均匀，中间要连续，不得有气泡或断纹，表面要平整。如凝胶床表面不平整，可用细玻璃棒轻轻将凝胶床上部颗粒搅起，待其自然下沉，即可使表面平整。凝胶床表面要保留1cm高的缓冲液。 3. 样品制备? 将维生素B2饱和水溶液和血红蛋白溶液按1:1(体积比)混匀。;4. 加样? 打开层析柱出口，使缓冲液缓缓流出，当液面与凝胶床表面平齐时，关上出口。用吸管吸取待分离样品溶液约0.5 mL，在接近凝胶床表面处沿层析柱内壁缓缓加入。打开层析柱出口，使样品溶液进入柱床。然后再用滴管沿层析柱内壁加入磷酸盐缓冲液，约1cm高。加样不可过多，以免分离不完全。;5. 洗脱? 将装有细玻璃管的橡胶塞塞住层析柱入口，使细玻璃管的下端插入液面，但不可卫生资格考试网接触凝胶床表面。将装有磷酸盐缓冲液的下口瓶调好位置，使其略高于层析柱，将其流出管接在层析柱橡胶塞的细玻璃管上，保持密闭状态。打开下口瓶出口，然后打开层析柱出口，使磷酸盐缓冲液缓缓流出，保持4~6滴/min的流速。洗脱速度不可过快，以免区带不清晰。;6. 收集? 随着层析的进行，凝胶床将出现两条明显的区带，血红蛋白区带在下，维生素B2区带在上。当血红蛋白区带即将流出时，开始收集，每管收集约1 mL，直到流出液变为无色为止，约需收集5~6管；以同样方法收集维生素B2。 7. 测定? 在540nm波长下，以磷酸盐缓冲液调零，测定血红蛋白和维生素B2各管吸光度。;8. 结果及分析? 以管号为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线。分析实验结果并说明原因。;注意事项; 记录原始数据、绘制洗脱曲线并分析实验结果 绘制实验装置图 思考题;凝胶柱的再生与储存;思考题;下周实验