噬菌体的快速检测与防治.docVIP

噬菌体快速检测方法 一、目的要求观察噬菌斑的形态和大小。　　学会快速检查发酵液中是否被噬菌体污染的方法。　　 二、基本原理 噬菌体是一类专性寄生于细菌和放线菌等微生物细胞的病毒，某种噬菌体往往只能感染一种或与它相近的某种细菌。按其感染细菌的过程分两类：大多数烈性噬菌体侵染细菌后迅速引起敏感细菌裂解，释放出大量子代噬菌体因而可在含有敏感细菌的平板上出现肉眼可见的噬菌斑图。温和噬菌体侵染细菌后呈原噬菌体（或称前噬菌体）状态，一般不引起细菌裂解，使宿主成为溶源性细菌。在肉膏蛋白胨双层琼脂平板上产生透明噬菌斑中心的菌落，即为溶源性细菌。了解噬菌体的特性，快速检查噬菌体，在生产和科研工作中防止噬菌体污染具有重要作用。 图1 敏感细菌的平板上出现肉眼可见的噬菌斑→侵入（注入DNA）→复制→成熟→裂解五步，寄生细胞裂解后释放出来的成熟子代噬菌体随时又侵染其他细菌，开始新的生活循环。 赖氨酸发酵中污染噬菌体，由于侵染时间和感染量的不同，以及噬菌体“毒力”和菌株敏感性的差异，表现症状是不一样的，一般泡沫多、pH偏高、OD基本不长甚至下降，轻度感染或后期感染常看不出异常变化，可用快速检测法。 三、实验材料 （一）菌种 　　菌。 （二）噬菌体来源 　　发酵异常发酵液。 （三）培养基 　　（四）仪器 　　台式离心机、721型分光光度计、显微镜、恒温水浴等。 （五）其他物品 　　培养皿、试管、、玻璃涂棒、离心管、等四、实验内容 （一）噬菌体污染检查生产或科研中使用的菌株，若被噬菌体污染，常有异常表现：接种的斜面或克氏瓶生长的菌苔上出现不长菌的透明区；液体发酵过程镜检菌体染色不均匀，细胞形态不整齐或膨大呈将破裂状，活细菌数目减少；发酵过程糖消耗减慢，氨基氮和pH变化异常；发酵液稀薄，发酵终产物产率降低等异常状况，以上多为被噬菌体侵染的现象。 目前采用生物测定法进行噬菌体检查，约需12h左右，这样不能及时判断是否有噬菌体污染，无法针对情况迅速采取必要的措施。快速检查大致确定是否被噬菌体污染可采用方法：1．显微镜直接检查定时取发酵液进行涂片染色，在显微镜下检查有无异常菌体取发酵正常发酵液和异常发酵液，涂片染色，显微镜观察菌体形态及生长情况。 2．离心分离加热法根据微生物细胞被噬菌体裂解后，其高分子内容物从细胞逸出的特点，采用发酵液离心分离后的上清液加热来快速检测噬菌体。原理是基于正常发酵液离心后菌体沉淀，离心后的上清液若蛋白含量不多，加热后仍清亮；侵染噬菌体的异常发酵液离心后的上清液因含高分子内含物，加热后自裂解菌中逸出有活性蛋白沉淀，在光线照射下出现丁达尔效应而不清亮。此法简单、快速，对发酵液污染噬菌体的判断亦较准确。但不适于溶源性细菌及温和噬菌体的诊断，对侵染噬菌体较少的一级种子培养液，也往往不适用。离心分离加热法取发酵正常发酵液和异常发酵液，4000r／min离心20min，分别取两组发酵液离心后的上清液（A1），在721型分光光度计上测定OD650光密度值；再分别将两组发酵液离心后的上清液（A1）5ml于试管中，置沸水浴中煮沸2min（A2），检测A2溶液OD650光密度值。）A1清亮； A2若有浑浊或明显浑浊或明显大块悬浮物则说明污染噬菌体。 但当出现明显浑浊后，悬浮物下沉料液清亮，这时若检测OD值可能会比A1的还低，出现误判断。这就要求料液煮沸冷却后必须目视比浊，若有轻微浑浊无法判断，过1h取样检测比较混浊度再做判断。 3. 平板交叉划线法： 取平皿按常规倒入培养基，制成平板，然后取指示菌液划线，再取与其交叉划线。37.5℃恒温培养10～12h左右。这种交叉划线检查法，当噬菌体较少时能发现噬菌斑，如果噬菌体较多，则发现交叉处透明，同时可见到由含噬菌体胶液 线向敏感菌线析展的一条亮线（噬菌带）。此法既可检查噬菌体，又可检查杂菌污染。 4．） 图2 敏感细菌的平板上（）噬菌体污染检查：　检验噬菌体的细菌，必须是敏感细菌纯种；加入培养皿中的对数中期菌悬液，应在皿中均匀形成菌层（每皿细菌密度约109个）。 　钙、镁等离子帮助噬菌体尾丝吸附于细菌表面，用自来水配制的肉膏蛋白胨培养基和蛋白胨水即可满足噬菌体增殖和检测需要，不必另外添加无机离子。培养基中的琼脂浓度对噬菌斑大小有显著影响，底层琼脂浓度以1.5％～2.0％，上层琼脂浓度以0.8％～1.0％为宜。噬菌体对温度极其敏感，一般噬菌体60 5min绝大部分失活。为保证获得单个、彼此分离的噬菌斑，培养皿盖上和培养基表面不得有凝结水滴，平置培养，不能倒放，每皿中噬菌体数量不能太多，维持100～300个为宜，否则噬菌斑不能分开而连成一片。 （） 抗生素等产品发酵过程中有时出现噬菌体污染,轻者造成生产能力大幅度下降,重者造成停产。 一般噬菌体污染后往往出现发酵液突然转稀,泡沫增多,早期镜检发现菌体染色不均匀