第五章、分子生物学研究法上.ppt

D. 基因的图位克隆法 通过构建遗传连锁图，将目的基因定位到某个染色体的特定位点，并在其两侧确定紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记。 通过对许多不同的生态型及大量限制性内切酶和杂交探针的分析，找出与目的基因距离最近的RFLP标记。通过染色体步移技术将位于这两个标记之间的基因片段克隆并分离出来。 根据基因功能互作原理鉴定目的基因。 六、蛋白质组与蛋白质组学技术 蛋白质组学（Proteomics）一词，源于蛋白质（protein）与 基因组学（genomics）两个词的组合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。 蛋白质组本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识，这个概念最早是由Marc Wilkins 在1995年提出的。 A、双向电泳技术 蛋白质组研究的基本技术路线 蛋白质样品的制备 双向电泳 图像分析 转印至膜上的蛋白 凝胶中的蛋白 溶液中的蛋白 混合肽 蛋白质质量 N端测序 肽序列质谱数据 肽指纹图 数据搜索 新的或已知蛋白 蛋白转录后修饰的鉴定 双向电泳（two-dimensional electrophoresis） 是等电聚焦电泳和SDS的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行SDS（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。 IEF(isoelectric focusing)等电聚焦 第一向进行等电聚焦，蛋白质沿pH梯度分离，至各自的等电点；随后，再沿垂直的方向进行分子量的分离 2-DE原理示意图 银染可检测少到2～5ng的蛋白 考马斯亮蓝：多数糖蛋白不能被考 马斯亮蓝染色 分辨率 重复性 染色方法 挑战 B、蛋白质印迹法 Western blotting 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法 Western免疫印迹 用于测定特定蛋白质的大小和含量 ? 基本原理 将经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白组分从凝胶转移至固相支持体上，以针对特定蛋白质的抗体作为探针，与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位进行特异性反应，结合上的抗体可用二抗检测。 常用的二抗是与辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶偶联的抗免疫球蛋白或A蛋白；实际应用中常常还需要设置适当的对照。 Western Blot一般流程 蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳 转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色 转膜 膜的选择 尼龙膜 硝酸纤 维素膜 封闭非特异性抗体结合麻烦 简单快速封闭非特异性抗体结合 价格昂贵 价格便宜 特殊要求下的选择 需要更高的蛋白结合率 （尼龙膜： 480μg/cm2 ；硝酸纤维素膜：80μg/cm2 ） 目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱 需要更大的机械强度 单克隆抗体 (Monoclonal Antibody,McAb) 单个B淋巴细胞克隆所分泌的抗体 多克隆抗体 (Polyclonal Antibody) 多个B淋巴细胞克隆所分泌的抗体 标记技术 标记技术 单抗 多抗 抗体组成 单一 复杂 抗体性质 个体的属性 群体综合的性质 纯化标记 容易，效果好 难度高一些 种属来源 绝大多数是小鼠 兔子、羊、豚鼠等 制备周期 长 (最短4个月） 短（2个月） 制备技术 复杂 简单 经费 多 少 什么情况需要制备单抗？ 目的蛋白有结构类似物 抗原不纯，无法分开 多抗效果不好（已排除非特异性反应） 希望将抗体用于治疗，研制成药品 希望将抗体用于诊断，研制成诊断试剂 抗体标记方法 放射性标记 酶标 生物素标记 第5步： 加