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课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段课件
课堂小结 在体外制造与体内相同的环境,进行DNA复制反应 缓冲溶液 DNA模板 与两条模板链结合的两种引物 PCR原理 PCR反应条件 四种脱氧核苷酸 耐热的DNA聚合酶 合适的温度 变性 复性 延伸 PCR反应过程 * 视频一: 魔术 小时候,我们经常为魔术师的经典魔术所惊叹,他们可以把一只鸽子放入帽子里,然后变出许多鸽子。 新课导入 美国科学家穆里斯就变了这样一个魔术,不过他变魔术的材料不是鸽子,而是是DNA。 他发明的PCR技术可以使DNA在反应30次后变为现在的109倍。 专题五 DNA和蛋白质技术 教学目标 知识目标 1.理解PCR原理。 2.了解PCR的应用。 3.掌握PCR的基本步骤。 能力目标 1.掌握PCR技术的基本操作。 2.体验分子生物学实验方法。 过程与方法 1.PCR基本知识的阐述。 2.学生在实验过程中巩固。 情感态度与价值观 1.激发学生对科学的兴趣。 2.培养学生善于思考的创新精神。 教学重难点 课题重点 1.PCR的原理。 2.PCR的基本操作。 课题难点 PCR的原理。 内容解析 基础知识 DNA复制的条件 解旋酶: 打开DNA双链 DNA母链: 提供DNA复制模板 4种脱氧核苷酸: 合成子链的原料 DNA聚合酶: 催化合成DNA子链 引物: 使DNA连接脱氧核苷酸 思考: 能否在体外模拟体内DNA复制条件,进行DNA扩增? PCR技术的原理 打开DNA双链 在80-100℃温度范围内,DNA变性,双螺旋结构解体,双链打开 DNA母链 解体后的双链为两条母链 合成子链原料 四种脱氧核苷酸 引物 与两条模板链结合的两种引物 DNA聚合酶 耐高温的TaqDNA聚合酶 温度 变性温度 94℃ 复性温度 72℃ 延伸温度 55℃ 温度>90℃,双链解旋为两条单链 PCR过程 90℃ 温度≈50摄氏度,两种引物分别与两条单链DNA结合 50℃ 温度≈70℃,在DNA聚合酶的作用下,根据碱剂互补配对原则合成新的DNA链 70℃ PCR反应详细解析 变性 A B 复性 A B 延伸 A B A 变性 A1 A2 A链PCR 复性 A1 A2 延伸 A1 A2 PCR终产物 B链PCR 变性 B B1 B2 复性 B1 B2 PCR终产物 延伸 B1 B2 A1 B2 同A链第二轮PCR反应 同B链第二轮PCR反应 试验设计 利用PCR技术扩增双歧杆菌的DNA的片段 双歧杆菌 培养基 离心机 微量移液器 化学试剂 PCR仪 1.双歧杆菌的培养 培养24h 培养基配方: 大豆蛋白胨 5g 酵母提取物 10g 微量盐溶液 40ml 葡萄糖 10g 半膀氨酸盐酸盐 0.5g 0.1%胰胨 5g 刃天青 1ml PH=7 2.PCR操作 菌液离心,保留底部双歧杆菌沉淀 在双歧杆菌沉淀中加入0.2ml裂解液,使细胞裂解,释放DNA 3.DNA处理 2.提取DNA 55℃加热孵育3h 90℃加热10min 冷冰中冷却 离心 1.菌体处理 4.其它组分添加 DNA上清液10μL 10倍扩增缓冲液 5μL 25mmol/L MgCl2溶液3μL 20mmol/L4种脱氧核苷酸的均匀混合液1μL Taq聚合酶1μL 两种引物各0.5μL 蒸馏水29μL 预变性 94℃,5min 30次重复反应 94℃,30s 55℃,30s 最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min 72℃,1min 5.PCR反应 变性 复性 延伸 6.PCR产物检验 分光光度计法 取2μL PCR DNA溶液,加入98μL H2O,使DNA50倍稀释 以蒸馏水为对照,在260nm处测样品DNA的光吸收值 根据公式计算DNA含量 DNA含量(μg/mL)= 50×(260nm度数)×稀释倍数 结果分析与评价 根据公式计算DNA片段的含量比扩增前增加了了多少倍。 相关链接 琼脂糖凝胶电泳法检测DNA含量 1.配制浓度为1%的琼脂糖凝胶,倒入电泳槽中,插好梳子 2.向电泳槽中加入电泳缓冲溶液,移去梳子 3.在DNA中加入载样缓冲液,混匀后,滴加到样品孔中 4.接通电源,电泳20-40min + - 5.EB 溶液染色,在紫外仪上观察电泳带及其位置,判断扩增情况 观察电泳带的粗细以及分布评价扩增的效果。 *
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