人源有机阴离子转运多肽1B1和多药耐药相关蛋白2双转MDCKⅡ细胞株的构建及其功能验证.pdf

134 人源有机阴离子转运多肽 1B1和多药耐药相关蛋 白2 双转 MDCKⅡ细胞株的构建及其功能验证 胡 楠 马 国 杨 青 。 (’复旦大学生命科学学 院生物化学系 上海 200438；复旦大学药学 院临床药学教研室 l：海 20121)3 云南天然产物与生物制药协同创新 中心 昆明 650091) 【摘要】 目的 构建人源有 机 阴离子转运 多肽 1B1(humanorganicaniontransportingpolypeptide1BI， hOATP1B1)和多药耐药相关蛋 白2(multidrugresistance—associatedprotein2，hMRP2)双转 MDCKII细胞株 ，验 证其功能，并应用其考察创新药物 2，3-双加氧化酶 (indoleamine2，3-dioxygenase，ID())抑制剂 1一甲基色氨酸 (1一 methyl—tryptophan，1-MT)的转运特性 。方法 采用基 因工程手段获得 hOATP1B1和 hMRP2表达真核载体 pVITRO2一SLCO1B1一ABCC2，转染 MDCKII细胞 ，通过遗传霉素 G4t8筛选得到稳定表达 的细胞株 ；通过 Real— timePCR、Westernblot、免疫荧光共聚焦显微镜确认 目的蛋白特异性 ；利用该双转模型考察普伐他汀 (不 同pH 环境和不 同底物浓度)和 1一MT的转运 。结果 经 电泳分析、双酶切 、DNA测序鉴定表 明重组质粒构建成功；通 过 Real—timePCR、Westernblot、免疫荧光共聚焦显微镜证明经遗传霉素筛选的MDCK—OATPIB1／MRP2细胞 构建成功；pH：6．5时，普伐他汀在所构建双转细胞模型上转运最佳 ；在 ()～500~／mol／I的浓度范围内，普伐他 汀在该模型上 的转运呈现浓度依赖性 。1-MT在该细胞模 型上无 明显转运 。结论 成功构建人源 MDCK- OATPIB1／MRP2双转细胞株 ，发现 1-MT既不是 OATP1B1蛋 白也不是 MRP2蛋 白的底物 ，该细胞株可用于 OATPIB1／MRP2介导的外源性物质(如药物)和 内源性物质 (如胆红素)的转运研究。 【关键词】 有机 阴离子转运多肽 1B1； 多药耐药相关蛋 白2； MDcKⅡ； 普伐他汀； 1一甲基色氨酸 ； 转运 【中图分类号】 R965．1，Q233 【文献标识码】 A doi：10．3969／j．issn．1672—8467．2017．02．()()2 Establishmentofdouble-transfectedMDCK Ⅱcellsexpressinghumanorgnaic anion transportingpolypeptide 1B1andmultidrugresistance。。associated protein2 and identificati0n ofitsfunctions HU Nan ，MA Guo ，YANG Qing,3A (DepartmentofBiochemistry，SchooloJLieeSciences，FudanUniversity，Shanghai20O438，China；DepartmentJ(，Clinical Pharmacy，SchoolofPharmacy，FudanUniversity，Shanghai21)1203，China；theCollaborativeInnovationCenterfJ，Yunnan NaturalProdu~’tsand BiologicalPharmacy。Kunming 650()91．Yunnan Province．(’^ina) [Abstract] Objective Toestablishdouble—transfectedMadin-Darbycaninekidney(MDCK )1Icells expressinghumanorganicaniontransportingpolypeptide 1B1(hOATP1B1)an