玉米HVA22基因启动子的克隆与功能.pptxVIP

玉米HVA22基因启动子的克隆与功能验证 本研究以水稻HVA22蛋白质的氨基酸序列为探针,搜索玉米基因组同源mRNA序列HVA22,用PlantCARE软件分析并同源克隆其上游启动子序列,实时荧光定量PCR验证HVA22基因在非生物逆境胁迫下的差异表达,构建HVA22基因启动子HVA22s启动GUS基因的表达载体,基因枪法转化玉米愈伤组织，GUS染色检测启动活性。 材料与方法 玉米HVA22基因启动子序列生物信息学预测与同源克隆 以水稻HVA22蛋白氨基酸序列为探针，在NCBI网站搜索玉米同源蛋白质mRNA序列，再与玉米“B73”基因组序列比对（BLAST）其同源编码序列，用启动子分析软件PlantCARE分析其编码序列上游1.5kb左右启动子特征。 设计特异性引物，并在5’端引入HindⅢ/BamHI的识别位点，用“B73”为模板扩增启动子序列，电泳回收纯化后双酶切目的片段。 玉米HVA22基因在非生物胁迫条件下的差异表达 研究方法：取自交系“X178”幼苗水培至四叶期，分别用ABA、乙烯、低温、高温、干旱和高盐条件处理，在几个时间点内取样提取RNA，反转录成cDNA后作实时定量PCR的模板。 以玉米18S基因作内参基因，采用双标准曲线法对HVA22基因的表达水平进行定量测定，计算不同处理时间HVA22基因表达量相对于oh对照的倍数。 玉米HVA22基因在非生物胁迫下差异表达 研究结果：qRT-PCR分析显示，玉米HVA22基因在模拟干旱、低温和高盐胁迫下均大幅下调表达，而高温胁迫、ABA和乙烯诱导下则表现不同程度的上调表达。 对于ABA处理2h与高温处理6h后的大幅上调表达，可能是玉米ABA信号转导途径对高温胁迫的迅速应答。 结合上述分析，推测玉米HVA22基因的启动子很可能具有非生物逆境诱导启动活性。 HVA22s启动子启动GUS基因表达载体构建 双酶切植物瞬时表达载体Pbi221-Ubi-GUS,分离回收和纯化去除Ubi启动序列片段，跟回收纯化的HVA22s片段用T4连接酶连接，构成HVA22s启动GUS基因的表达载体Pbi221-HVA22s-GUS，热激转化大肠杆菌感受态，涂氨苄抗性培养基筛选阳性重组子，扩大培养后经菌液PCR和双酶切检测，最后测序验证。 玉米愈伤组织的基因枪法转化及GUS基因瞬时表达检测 取瞬时表达载体和含单子叶组成型启动子的表达载体（内参对照），在一定条件下转化到玉米胚性愈伤组织中，转化后的组织转移到继代培养基上培养两天，取愈伤组织实施高盐、ABA和低温诱导，用GUS染色显微镜观察。 结果发现GUS染色出现靛蓝色斑点而空白对照没有显色，说明HVA22s确有非生物逆境启动功能。 结论 本研究从基因启动子 HVA22s的序列分析，HVA22基因在高温、高盐、干旱、低温胁迫和ABA、乙烯诱导下的差异表达，以及 HVA22S启动 GUS基因转化玉米愈伤组织在非生物逆境胁迫条件下的瞬时表达几个方面，均证明玉米 启动子HVA22s响应多种非生物逆境胁迫。