烟草基因组中NBS类抗性基因分析.ppt

2 进化分析 进一步对RGA亚家族选择进化进行分析。RGA基因进化历程可能是处于一种中性随机突变状况（M1a和M7模型）或受到正向或负向（又称净化）的选择（M2a和M8模型）。根据Yang等（2005）方法(Yang et al., 2005)，我们可以估计烟草RGA基因亚家族成员的序列构成符合哪个进化模式。结果表明 在测验的8个RGA基因中，大多受到强烈的净化选择，同时部分基因在其个别位点上受到明显的正向选择。 烟草RGA基因亚家族进化选择测验（似然比）结果 考虑到测序等误差，所选用的每个RGA亚家族成员间序列差异度≥1% (Couch et al., 2006) 烟草基因组RGA基因的系统进化关系 通过PCR产物直接测序和克隆测序，共获得426条特异RGA基因序列，包括来自栽培烟草11个RGA家族的293条基因序列和19条野生烟草的基因序列。经注释，除了部分由于移码、终止子等导致的假基因，其中绝大多数序列可以获得完整的NBS蛋白质序列。为了确定这些基因序列的系统进化关系和亚家族归属，我们对获得的所有序列和已知烟草和其他主要类型抗性基因进行了系统进化分析。从系统进化树可以看出，我们鉴定的烟草RGA几乎覆盖了所以类型的已知抗性类型，包括TIR-NBS类和大量非TIR-NBS类基因。非TIR-NBS类基因中，烟草中一个烟草亚家族（I2，红色部分）已进行一定数量的测序调查(Couch et al., 2006)，我们获得的数据也同样包含了这类RGA基因序列。同时，与已知抗性基因有较大差异的一批烟草RGA被发现，这部分RGA基因表现出烟草RGA的特异性，其中部分可能是烟草特有的RGA。 基于RGA蛋白质序列和临接法（NJ）构建的烟草RGA基因系统进化树 图中包括本研究获得的烟草NBS类抗性基因（黑色）、GeneBank数据库中已有烟草RGA基因序列（红色）和目前已克隆抗性基因（其他颜色）。 烟草RGA类抗性基因SSR分子标记开发 前期对烟草RGA基因进行了基因组分析，发现了一大批烟草RGA基因，遗传多态性分析结果表明，烟草RGA基因存在高度的遗传同质化，这给发现与抗性相关RGA增加了难度。 为了探索获得与抗性相关RGA或相应标记的高效途径，本研究利用烟草基因组序列开发了与RGA紧密连锁的SSR标记。 分子标记开发流程 在基因组中查找含有RGA区段的序列 在其上下游寻找SSR序列 设计引物 23个烟草材料中进行PCR扩增 用于开发烟草SSR标记的23个栽培烟草品种及其野生种基本信息 序号 品种名称 类型 抗性 原产地 黑 青 根 CMV 蚜 1 小黄金1025 烤烟 山东 2 红花大金元 烤烟 -- - ++ ++ --- 云南 3 K326 烤烟 -- - ++ -- ++ 美国 4 Hicks Broad Leaf 烤烟 - - -- - 美国 5 301 雪茄 + - - 美国 6 （沙姆逊） 白肋 - - - 阿尔 巴尼亚 7 burley 21 （白肋 21） 白肋 - -- --- 德国 8 TN86 白肋 - 美国 9 土耳其巴斯玛 香料 土耳其 10 N.undulata 野生 秘鲁 11 N.glutinosa 野生 - ++ -- 秘鲁 12 N.sylvestris 野生 - - 阿根廷 13 N.repanda 野生 - - + 墨西哥 14 N.plumbaginifolia 野生 + - -- 阿根廷 15 Ambalema 晒烟 -- - ++ - --- 美国 16 TI 晒烟 ++ - – - --- 国外 17 Beinhart 1000-1 雪茄 + - -- 美国 18 长脖黄 烤烟 - - -- --- + 河南 19 斯佩特 基-28 烤烟 ++ - -- --- 美国 20 云烟87 烤烟 -- ++ ++ 云南 21 Coker 176 烤烟 ++ ++ ++ -- --- 美国 22 C151 烤烟 O 广东 23 NC82 烤烟 -- -- - -- - 美国 注：黑：黑茎病；青：青枯病；根：根结线虫病；CMV:烟草花叶病毒病；蚜：烟蚜； -：感病；--：中感；---：高感。+：抗病；++：中抗。O：耐病。 开发烟草中与RGA相关的SSR标记设计的引物 引物名称 正向引物（FWD_PRIMER） 反向引物（REV_PRIMER） 重复基元 目的片段（bp） 退火温度（℃） TSN1001 GGCCTGCATGAATAAAAGAAAGAA CCTCCCATGAAGATTGTATGAACA GA 158 55 TSN1002 CAGAGGTTAAACCAACCCAAAATC ACCCATGGAGGAATGGCTAG