- 1、本文档共17页,可阅读全部内容。
- 2、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
- 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载。
- 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
查看更多
第二篇 细胞的遗传物质
第三章 基因表达的分析技术
生物性状的表现均是通过基因表达调控实现的。对基因结构与基因表达调控进行研究,是揭示生命本质的必经之路。在基因组研究的过程中,逐步建立起一系列行之有效的技术。针对不同的研究内容,可建立不同的研究路线。
第一节 PCR技术
聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术是一种体外核酸扩增技术,具有特异、敏感、产率高、快速、简便等突出优点。。PCR技术日斟完善,成为分子生物学和分子遗传学研究的最重要的技术。应用PCR技术可以使特定的基因或DNA片段在很短的时间内体外扩增数十万至百万倍。扩增的片段可以直接通过电泳观察,并作进一步的分析。
PCR是根据DNA变性复性的原理,通过特异性引物,完成特异片段扩增。第一,按照欲检测的DNA的5'和3'端的碱基顺序各合成一段长约18~24个碱基的寡核苷酸序列作为引物(primer)。引物设计需要根据以下原则:①引物的长度保持在18~24bp之间,引物过短将影响产物的特异性,而引物过长将影响产物的合成效率;②GC含量应保持在45~60%之间;③5'和3'端的引物间不能形成互补。第二,将待检测的DNA变性后,加入四种单核苷酸(dNTP)、引物和耐热DNA聚合酶以及缓冲液。通过95℃变性,在进入较低的温度使引物与待扩增的DNA链复性结合,然后在聚合酶的作用下,体系中的脱氧核苷酸与模板DNA链互补配对,不断延伸合成新互补链,最终使一条DNA双链合成为两条双链。通过变性(92~95℃)→复性(40~60℃)→引物延伸(65~72℃)的顺序循环20至40个周期,就可以得到大量的DNA片段。理论上循环20周期可使DNA扩增100余万倍。二、PCR技术的分类及其应用范围
1.逆转录PCR 逆转录PCR(RT-PCR)是将RNA反转录和PCR结合而建立起来的一种PCR技术。其包括两个过程:通过逆转录合成cDNA和对之进行PCR扩增。其中,用于逆转录的RNA模板要求完整,并且不含DNA和蛋白质等杂质。逆转录PCR可以检测低于10个拷贝的特异RNA。
2.原位PCR 原位PCR技术(in situ PCR)是将检测细胞内特定基因的原位杂交技术和聚合酶链式反应(PCR)法相结合的方法。它是扩增组织切片或细胞内微量的基因,并将其检测出来的技术。
3.甲基化PCR 甲基化PCR与常规PCR在原理上一致,但在引物的设计以及DNA样本的处理上有所不同。针对扩增的DNA甲基化区域,一般需要设计三条引物:正常序列引物、甲基化对应引物以及DNA序列修饰引物。通过三组PCR,判断DNA序列中甲基化的存在与否。
4.实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR(real time quantitative PCR)是在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实现实时监测整个PCR进程,并能对起始模板进行定量分析。RT-PCR需要荧光探针参与,常用的探针可分为以下几类:1)内掺式染料SYBR Green I;2)序列特异性探针:Taqman, Molecular Beacons, Dual Probes; 3)特异性引物: Amplifluor(Intergen), Lux引物, Scorpion; 4)阴阳探针。
荧光定量PCR不仅可以测定靶DNA的含量,用于临床诊断,而且可以应用不同的探针检测基因突变和SNP分析。
5.多重引物PCR 多重引物PCR是在同一扩增体系加入多对引物,同时扩增多个基因片段的PCR技术。其技术的优点是通过一次扩增可诊断几种疾病或同一疾病的几个不同的基因突变。
6.随机引物PCR 多态DNA的随机扩增 (random amplication of polymorphic DNA,RAPD)或随机引物PCR(arbitrarily primed PCR,AP PCR)是应用基因组DNA中单一、随机序列的短引物,通过PCR扩增产生一组代表种或株特性的DNA片段。因此,RAPD是获得种或株的DNA分子指纹图谱的通用方法。
7.套式PCR 又称巢式PCR,是对靶DNA片段设计两套引物系统,第1套引物扩增15~30个循环,再用扩增的DNA片段内设定的第2套引物扩增15~30个循环,可使目的DNA序列得到高效扩增。套式引物PCR可减少引物的非特异性扩增,增加特异性扩增,减少PCR的误诊率。
8.突变体构建PCR
(1)应用载体构建突变体的PCR:原理是将野生型目的基因的cDNA插入到克隆载体上,设计携带突变点的一对引物,对克隆载体进行扩增,然后将经过PCR而获得的DNA转染感受态细胞,并用筛选培养基筛选转染的细胞,获得的克隆可以通过细胞扩增,获得大量的携带突变体DNA的载体。
(2)应用内外引物构建突变体的PCR
您可能关注的文档
- 第二讲核酸的化学.ppt
- 第二节促进身心健康第二节正确使用药物.ppt
- 第二节富集在海水中元素---氯.doc
- 公共安全风险防控及应急技术装备重点专项.doc
- 公共安全风险防控及应急技术装备重点专项2017年度项.PDF
- 公共经济研究的新视角我国公害品的界定、分类和治理.PDF
- 公共卫生科学与公共卫生学校的巨大挑战与机遇.ppt
- 公路测量自由设站法的应用和其图形分析.doc
- 公式中单价分别为提供消费市场牛、羊、马、驴、骡等.doc
- 第二节教学目标分析.ppt
- 2010-2023历年福建省三明九中高二上学期第二次月考政治试卷(带解析).docx
- 2010-2023历年福建省三明一中高二下学期第一次月考化学试卷(带解析).docx
- 2024年中国打捞工具市场调查研究报告.docx
- 2024年中国针市场调查研究报告.docx
- 2024年中国氟氯氰菊酯水乳剂市场调查研究报告.docx
- 2010-2023历年福建泉州泉州一中高三上期期中考试生物卷(带解析).docx
- 2010-2023历年福建省三明一中、二中高三上学期期末联考物理试卷(带解析).docx
- 2010-2023历年福建省泉州市第一中学八年级上学期期中考试地理试卷(带解析).docx
- 2010-2023历年福建省安溪第一中学高二上学期期中考试物理试卷(带解析).docx
- 2010-2023历年福建省厦门第一中学高二第一学期期中考试政治试卷.docx
文档评论(0)