白酒窖泥新菌种的筛选新方法.ppt

低年份与高年份窖池窖泥中古菌都分为3个属，甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、甲烷囊菌属(Methanoculleus)是两者共有的菌属；甲烷粒菌属(Methanocorpusculum)是低年份窖池窖泥的特有菌；甲烷杆菌属(Methanobacterium)是高年份窖池窖泥中的特有古菌。 * 从门的层次来对窖泥微生物进行分类，低年份窖池窖泥细菌主要分为2个门，厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)。高年份窖池窖泥细菌主要分为三个门，厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和放线菌门(Actinobacteria)，其中放线菌门只在老窖池窖泥中检测到。 * 从属的水平上进行统计，芽孢杆菌属(Bacillus)是新窖池窖泥的第一优势菌群，占22.74%，其次是第四类梭菌属和理研菌属；而在老窖池窖泥中，芽孢杆菌属(Bacillus)丰度明显下降(12.94%)，第四类梭菌属丰度明显上升。 * A值1×106copies/g窖泥和R值10可能是初步判断老窖泥老熟与老化的重要临界点。 * 成果体现的主要几个方面： 以己酸菌分离、强化为主的优质窖泥制备和窖泥维护 己酸菌、甲烷菌相互作用理论对人工窖泥制备的指导 窖泥微生态理论及其营养因子对活性窖泥制备的促进 基于免培养技术的窖泥微生物区系的系统研究及大量未培养菌种的发现 优势菌、特征菌的分类鉴定及窖泥性状的分子生物学描述 免培育技术指导下的功能菌筛选、分类鉴定及窖泥强化应用 窖泥微生物的研究和应用 经典微生物技术 分子生物学技术 PCR-DGGE PCR-克隆文库技术 高通量测序技术 qPCR FISH 菌落原位杂交技术 窖泥微生物研究主要分子生物学技术 不同年份窖泥细菌群落结构解析(DGGE) 高、低年份窖泥16S rDNA全序列克隆分析 研究成果—窖泥群落结构解析(16S rDNA全序列克隆) 2.窖泥微生物研究现状 低年份窖泥细菌16S rDNA克隆系统发育树 高年份窖泥细菌16S rDNA克隆系统发育树 窖泥微生物群落结构分析（高通量测序） 低年份与高年份窖池窖泥细菌“属”水平分类丰度图 研究成果—窖泥群落结构解析(qPCR) 老熟与老化窖泥微生物丰度分析（qPCR） 不同酒厂不同性质窖泥表征微生物的qPCR结果 酒厂 窖泥 样品 A值 氨基酸杆菌属copy数 (copies/g窖泥) 拟杆菌门copy数 (copies/g窖泥) 厚壁菌门copy数 (copies/g窖泥) R值 (厚壁菌门copy数 /拟杆菌门copy数) 文王 S 1. 4×106 3.1×1011 6.1×1011 2 H 1.0×105 6.0×109 3.1×1011 50.6 渔樵仙 S1 1.0×107 1.3×1012 2.0×1012 1.5 H1 6.0×105 2.1×108 8.6×109 41.4 S2 1.1×107 2.8×1012 2.3×1012 0.8 H2 8.0×103 1.1×108 9.7×109 88.2 缘河 S 3.0×107 7.1×1011 2.8×1012 3.9 H 1.1×105 4.8×108 2.0×1010 41.6 沱牌 S 7.0×106 1.1×1012 2.3×1012 2.1 H 5.0×105 1.4×109 1.4×1010 10 金种子 S 4.2×106 1.9×1010 3.0×1010 1.57 H 9.5×105 1.0×1010 1.0×1011 10 巴蜀液 S 1.0×106 4.1×1010 9.1×1010 2.2 H 2.3×103 4.3×107 2.9×109 67.4 H：酒厂老化窖泥；S：酒厂老熟窖泥 A≥1×106 与 R＜10 窖泥老熟与老化重要临界点 基于传统分离培养技术筛选窖泥中特定微生物菌落 放线菌 放线菌 酵母菌 细菌 细菌 霉菌 窖泥微生物的分离培养与筛选 基于16S rDNA克隆技术、DGGE分析与厌氧培养技术结合。 窖泥特定功能微生物菌种的筛选 采用厌氧培养技术与菌落原位杂交技术（斑点杂交技术）对窖泥中的特征菌Clostridiaceae 1进行分离筛选获得Clostridium kluyveri 14。 菌落原位杂交结果 菌株14细胞形态图 窖泥特定功能微生物菌种的筛选 结合厌氧培养技术、FISH与色谱技术，筛选到高产己酸的混合菌J30。 FISH检测液体培养中己酸菌的生长情况 窖泥特定功能微生物菌种的筛选 窖泥微生物研究的论文 3、窖泥功能性微生物的筛选 基于分子生物学技术的窖泥微生物的筛选 常规筛选方法及依据 筛选一般常见菌种 错判、漏判 复杂环境微生物体系 无法有目