可内化的人源抗Met基因工程抗体Fab的亲和力成熟和特性分析.pdf

ResearchPapers 研究报告 生物化学与生物物理进展 ProgressinBiochemistryandBiophysics 2007,34(1):73~79 可内化的人源抗Met基因工程抗体 Fab的亲和力成熟与特性分析 1,3) 1,2) 1) 1) 1,2)* 1) 1)* 朱 进 赵 萍 焦永军 王 昕 曹伯良 冯振卿 管晓虹 1) (南京医科大学卫生部抗体技术重点实验室，南京 210029； 2) VanAndelResearchInstitute,AntibodyLaboratory,MI,49503,USA； 3) 南京军区军事医学研究所，南京 210002) 摘要 应用噬菌体展示技术制备抗Met(HGF受体，一个与肿瘤发生、侵袭和转移相关原癌基因产物)特异性、高亲和力的全 人Fab片段.Fab基因分三步合成，以从错配PCR突变库中筛选出的Fab基因可变区为模板，扩增VH和VL基因，分别与 CH1、CL基因融合，合成Fd和L基因，再拼接合成Fab基因，克隆于pComb3XSS中，构建Fab次级抗体库.经细胞筛选 和固相筛选，获得高亲和力阳性克隆.工程菌经IPTG诱导表达，SDS和蛋白质印迹分析，在25ku和27ku出现预期 大小蛋白质条带.Fab分子经流式细胞术、免疫沉淀、细胞免疫荧光检测，结果表明，Fab能够与S114和MKN45细胞膜上 的Met胞外区特异性结合，而与阴性细胞NIH3T3不结合.抗体内化分析显示，Fab能够与标记肥皂草毒素(ZAP)的抗人IgG 结合，并进入细胞内，抑制Met阳性细胞的生长，揭示该抗体能够与Met特异性结合，并且被细胞内化.该抗体有望成为肿 瘤临床诊断或治疗的候选分子. 关键词 肝细胞生长因子受体，噬菌体抗体库，亲和力成熟，内化抗体 学科分类号 Q78 随着恶性肿瘤对人类健康威胁的加剧，抗肿瘤 体的临床应用，有上百种抗体药物已进入临床或后 研究已成为当今生命科学中极富挑战性且意义重大 期临床试验，如抗肿瘤抗体药物 Herceptin、 的领域.研究发掘选择性作用于特定靶点的高效、 Rituxan等在美国相继批准用于临床，单抗治疗得 低毒、特异性强的新型抗癌药物是当今抗肿瘤药物 到了迅速发展，成为生物技术药物研究开发的热 [7] 研究的重要方向.而以酪氨酸激酶为靶点的药物研 点 .为了克服单克隆抗体分子质量过大、免疫原 [1,2] 发已成为国际抗肿瘤药物研究的热点 .目前为止， 性强等缺点，科研人员发展了嵌合抗体、人源化抗 已有十多种蛋白酪氨酸激酶抑制剂和抗体进入临床 体、天然全人抗体以及转基因小鼠等技术，在此基 或临床前试验阶段，并取得了令人鼓舞的治疗效 [8] 础之上开发出许多小分子抗体片段 .由于基因工 果，如 1998年美国食品和药物管理局 (Foodand 程抗体自身的特点，使其在肿瘤的导向治疗、抗病 DrugAdministration，FDA)批准Herceptin用于治 毒治疗、基因治疗及临床诊断等方面均得到发展, [3] 疗某些HER2阳性的转移性乳腺癌 .蛋白酪氨酸