流式细胞仪荧光补偿.doc

流式细胞仪荧光补偿(一) 在流式细胞仪分析中用到的“荧光补偿”这个术语是指修正荧光渗漏的过程,如从探测器除去除匹配荧光以外的任何荧光信号。荧光补偿过程从原理上来说相对简单，但实际上涉及许多精细、敏感的方面从而使在实践操作相当复杂。 非常不幸，荧光补偿操作可能是在流式操作中的数据采集和分析等步骤中最少被了解和掌握的内容，可能是因为在介绍它时经常要用到线性代数来计算，并且还要求了解它的产生原理。然而，正确的荧光补偿对于许多流式分析来说绝对是至关重要的，特别是对现常见的多抗原荧光表达强度分析。因为荧光补偿常被误解、误用并被许多不正确的观念所包围，许多实验室的荧光补偿设置都不正确。本章的一个部分将剖析有关补偿的一些疑惑问题。 图1显示在设置荧光补偿中常犯错误。本章将致力于从以下方面阐述流式细胞仪荧光补偿问题：为什么它是必须的，它是如何通过硬件或软件来完成的，荧光补偿是如何时影响数据视觉效果的，最后是如何设计一个最佳的实验来获得一个正确的荧光补偿。通过完整地阅读本章节，读者将学会为实验正确地设置荧光补偿并在出版物中识别出补偿设置不当的数据，并能够明白这些错误是如何影响分析结果的。尽管全面的阐述荧光补偿不可避免地要涉及到一些线性代数的问题，但正确掌握荧光补偿并不一定要求要掌握它；在这两部分内容中的问题可根据你的意愿撇去或跳过。 大部分的流式用户不能正确回答图1中的三个问题。对于问题1的正确答案是“样本2”。对于问题2，答案中十字门虚线的位置就不正确。最后，第三个问题的正确答案是：“不可能决定哪个图形中的荧光补偿是正确的”，因此其中没有哪个可以说中正确的。 如果一个正确的荧光补偿对于流式数据分析这么重要，并且又这么少的人知道如何正确地去设置它，而为什么到目前为止流式细胞仪的分析结果还都不错。对于此问题的简单答案是绝大多数类型的数据分析并不绝对需要正确的荧光补偿。此问题的另一个答案是不正确的荧光补偿在双色或三色分析中显得并不十分重要。然而随着五色分在大多数实验室中开展，如果这些个问题持续下去将会导致实验失败。 举例来说，思考在图1中的图谱，可以发现即使荧光补偿并不正确但仍可以正确计算细胞亚群的比例。然而计算这些细胞亚群的比例必须以单染的样本为对照，而不是以各个荧光的同型对照染色为对照！正确的设门应该是以CD3FITC和PEisotype染色样本为基础。 图1中还显示了荧光补偿在正确检测抗原荧光表达强度中重要影响。在此，任何不正确的荧光渗漏都会误导分析结果。此外，正确的荧光补偿在将弱阳性群体与阴性群体正确区分中有极其重要的作用；荧光补偿不足会导致弱阳性群体是假阳性颗粒增多，而过度补偿则会丢失弱阳性群体而导致假阴性。 注意在补偿调节不当的数据中正确计算的亚群数量的现象在三色或更多荧光分析实验中可能不成立。在本章的结尾将给出一个计算失败的这种案例。此外还讨论了如何为分析数据设计一个正确的染色对照（甚至当荧光补偿设置并不正确时）。这些称为“缺一型荧光染色”或FMO对照是进行正确多色荧光分析的前提保证。 荧光补偿基础 荧光补偿是指修正荧光光学信号在探测器之间相互渗漏并被数字化检测的过程。 图1 你能看出以上哪个样本的补偿是正确的吗？在这个假设实验中模拟了外周血用FITC标记的CD3和PE标记的阴性对照作为质控物。在（A）和（B）中，居左上方的图形显示了未调节补偿的数据。每张以数字编号的图形显示补偿设置逐渐增加的过程（FITC与PE两探测器之间）。在B组图中，显示了同一样本的检测数据，但在信号收集时PE探测器的电压很低。请回答问题：（1）在A组图中（1、2、3、4）哪个补偿调节是正确的？（2）你是依据什么来判断的？（3）在B组图中哪个补偿调节是正确的？请在本文的介绍部分参阅以上问题的答案。 自单激光双色分析出现后此过程变得十分重要。每种荧光素分子都具有自身的光谱发射范围。这些发射光谱之间存在相互叠加，在某些情况下此现象十分明显。举例来说，如图2为FTIC与PE荧光发射光谱的叠加情况。在一个双探测器系统中，可设计将FITC荧光从PE荧光中分离出来。检测荧光发射光时根据其波长和分布将选择其中一小部分进入探测器，这部分荧光可由不同的滤光片从全部发射光中选择特定波长范围的荧光来获得。这样，FTIC荧由530nm的滤光片选择后送入探测器中；PE荧光则是由575nm滤光片来选择。但是有部分FITC荧光会出现在PE探测器中，这是因为它的发射光涵盖两个探测器滤片的过滤范围。这部分信号我们称之为荧光渗漏，因为它是由FITC荧光渗漏到PE探测器中的。注意想要设计一组荧光滤片来只收集FITC或PE信号是不可能的；因为当同事使用这两种荧光染料时荧光叠加总是存在的。这样只要FITC荧光存在，就会在530nm区得到一个信号，同时也会在575nm区得另一些信号。如这时有P