大肠杆菌生产琥珀酸的工程菌种研究进展.PDFVIP

大肠杆菌生产琥珀酸的工程菌种研究进展 作者：戴昊 上海交通大学生命学院研究生 学号：5050809403 摘要：琥珀酸是一种用途非常广泛的工业原料，但传统以石油产品为原料的化学合成方法带 来了高价格和高污染，通过微生物发酵法生产琥珀酸正越来越引起人们的关注。大肠杆菌是 目前研究的较多的产琥珀酸菌种，具有基因组和蛋白质组的信息了解完全，代谢途径也基本 清楚，易操作、生长速率快、易培养及利用碳源广等诸多优点，目前，人们正通过将基因工 程与发酵工艺结合的方法，使大肠杆菌大规模发酵琥珀酸成为可能。 关键词：大肠杆菌，琥珀酸，工业微生物 1．引言 琥珀酸（succinic acid ）又名丁二酸，分子式为HOOC-CH -CH -COOH，分子量118.09， 2 2 常温下为无色结晶，味酸，可燃；可溶于水、乙醇、丙酮、甘油、乙醚，但几乎不溶于苯、 二硫化碳、四氯化碳和石油醚。在生物体内是三羧酸循环的中间产物，广泛存在于各种生物 中，在琥珀中含量可达7.8 ％，在当归、藤桔、夜关门、半边莲、草珊瑚等植物的某些部位 含量丰富。 琥珀酸可用于食品和药品，并已被美国 FDA 认定为 GRAS （一般认为安全）。琥珀酸 也可作为工业原料而广泛应用于农药、染料、香料、油漆、塑料等行业，还可以作为C4 平 台化合物，合成一些重要的化工产品如丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯、n- 甲基吡咯烷酮(NMD)、 2-吡咯烷酮等，用途十分广泛。另外，琥珀酸还可用来合成可降解的生物聚合物，如聚丁烯 琥珀酸酯（PBS ）和聚酰胺，使其成为最具潜力的大宗生物化学品之一。 传统的化学合成方法以石油化工产品丁烷为原料，通过顺式丁烯二酐生产得到琥珀酸， 这种方法不仅会因为石油价格上涨而导致成本上升，还会造成环境污染，抑制了该产品的发 展潜力和应用范围，因此微生物发酵法生产琥珀酸的研究越来越引起人们的兴趣，早在 20 世纪90 年代初美国能源部就投资700 万美元进行琥珀酸的发酵和提取研究，目前的发酵工 艺已经能使琥珀酸的销售价格降为2.20 美元/kg ，随着产量扩大和发酵工艺的不断改进，可 以预期，琥珀酸的发酵法生产将逐步从食品行业扩展到各个工业领域。 琥珀酸是一些厌氧和兼性厌氧微生物代谢途径中的共同中间物，很多细菌能生产并分泌 琥珀酸，但天然菌株往往不能产生过量的琥珀酸，产量很低，且产物多种多样，对糖或琥珀 酸的耐受性也很差，因而，要使这些菌种应用于发酵生产，必须运用发酵工程和基因工程对 现有的菌种进行改造，目前研究的较多的主要是产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniproducens) ，产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes) 和大肠杆菌(Escherichia coli) 等菌种。 2 ．大肠杆菌生产琥珀酸 大肠杆菌在氧气缺乏的情况下，通过发酵糖或其衍生物，产生甲酸、乙酸、乳酸、琥珀 酸、乙醇等物质[1] 。通常情况下，大肠杆菌不会过量合成琥珀酸，因此其琥珀酸的产量很低， 通常为每100 mol葡萄糖产12mol琥珀酸，但大肠杆菌作为典型革兰氏阴性细菌，其基因组 和蛋白质组的信息了解完全，代谢途径也基本清楚，且具有易操作、生长速率快、易培养及 利用碳源广等诸多优点，因而正受到越来越多的重视。人们正通过将基因工程与发酵工艺结 合使大肠杆菌大规模发酵琥珀酸成为可能。许多代谢工程策略已经用于提高大肠杆菌琥珀酸 [2-8] 的产量 。 2.1 ．改变关键酶基因的表达 PEP在E.coli 的代谢中占据重要位置，它是糖酵解途径的最后一步反应的中间物，又是 琥珀酸生物合成途径中第一步羧基化反应的底物。目前，E.coli 为PEP羧化酶和PEP羧化激酶 编码的基因ppc 和pck 已被克隆。Millard等人[9]将这2 个基因分别克隆在表达型质粒pJF118EH 中，并置于tac启动子的控制下。重组质粒转化至大肠杆菌JCL1208 株，发酵时以37g/L的葡 萄糖为碳源，经诱导后，PEP羧化酶和羧化