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植物生理学通讯 第41卷 第3期，2005年6月 36 5 教学园地 Teaching 关于茚三酮法测定脯氨酸含量中脯氨酸与茚三酮反应之探讨 李绍军 龚月桦 王俊儒 梁宗锁* 西北农林科技大学生命科学学院，陕西杨凌712100 测定脯氨酸含量的方法通常用磺基水杨酸或 述主要在植物生理学逆境指标测定脯氨酸含量实验 [1,2,9~12] 酒精提取再与酸性茚三酮反应生成稳定的红色产 中 。这些文献认为脯氨酸与酸性茚三酮反应 物，然后于波长520 nm处比色，通过标准曲线 生成红色物质，有互变异构体I和II(图2)。产物 或回归方程计算脯氨酸的含量。关于其测定原 在酸性条件下最大吸收峰520 nm，碱性条件下最 [10] 理，一些植物生理学实验指导明确指出：“在酸 大吸收峰630 nm。反应体系是醋酸缓冲液、水 性条件下，脯氨酸和茚三酮反应生成稳定的红色 合茚三酮、脯氨酸。 产物，用比色法于520 nm波长下测定脯氨酸的含 [1,2] [3~6] 量。” 然而，在各种生物化学教科书 中描述 氨基酸茚三酮反应时，则为：“在弱酸性条件 下，2个亚氨基酸——脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮 反应并不释放NH，而直接生成黄色化合物，其 3 结构式如图1，最大光吸收在440 nm。”为了对 两种教材中不同的说法进行比较，我们查阅了各 种文献，设计一些试验并进行了验证。 图2 红色产物互变异构体I和II 通过资料对比我们提出以下几个问题：(1)有 图1黄色产物 无氰化物对反应产生何种结果？(2)酸性体系以柠 檬酸为好还是醋酸为好？(3)产物在水相好还是甲 1两种说法的来源 苯相中更好？我们设计了相应试验并进行了验证。 关于黄色产物及其最大光吸收在440 nm的描 2验证试验 [3~6] -1 述广泛存在于国内生物化学教科书 和少数植物 实验中用到的试剂有：10g·mL标准脯氨 [7] 生理学实验指导 中，生化教科书一般没有指出 酸溶液、酸性茚三酮溶液(2.5 g茚三酮，加入60 该反应的具体反应体系，文献7在 “实验55”中 -1 mL冰醋酸和40 mL 2 mol·L 磷酸，于70℃下加 同意生化教科书的说法并有详细步骤，根据其中 热溶解，冷却后贮于棕色试剂瓶中备用)、分析 [8] -1 的参考文献我们发现其主要来源于Hyman的文 纯冰醋酸、0.2 mol·L pH 5.0的柠檬酸溶液、 献。文献8指出其反应体系由NaCN、醋酸缓冲 KCN。用各自不加脯氨酸的体系溶液调零，以龙 液、水合茚三酮组成，脯氨酸或羟脯氨酸与之反 尼柯(上海)仪器有限公司WFJ 7200型可见光分光 应后的产物是黄色的，最大吸收峰在440 nm。文 光度计测定可见光区域实验产物的吸收曲线。 献7来源是8，反应体系更改成为KCN、柠檬酸 缓冲液、水合茚三酮、脯氨酸。在文献7第3版[1] 收稿 2004-11-12修定 　 2005-01-27 中则取消了这个试验。