5.3-血红蛋白的提取和分离课件111.ppt

3.样品加入与洗脱 ①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。 ②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。 ③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。 ④洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。 ⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功） ⑥注意：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。 3.样品的加入和洗脱 3.样品加入与洗脱 注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。 收集得到的纯化后的血红蛋白 注意事项 1. 红细胞的洗涤： 洗涤次数不能过少；低速、短时离心。 2. 凝胶的预处理： 沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡 3. 色谱柱的装填： 装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。 4. 色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。 为什么？ 观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。 三、实验结果分析与评价 1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？ 三、实验结果分析与评价 2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？ 由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。 如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。 3、你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？ 三、实验结果分析与评价 课题3 血红蛋白的提取和分离 专题5 DNA和蛋白质技术 一、基础知识--蛋白质提取和分离原理 蛋白质提取与分离的依据－－蛋白质的物理化学性质： 形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、 亲和力等千差万别。 提取分离方法 凝胶色谱法 凝胶电泳法 （1）原理： （2）材料 大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快； 小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。 多孔性的多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。 (一)凝胶色谱法 （3）分离过程 混合物 上 柱 洗 脱 大分子流动快 小分子流动慢 收 集 大分子 收 集 小分子 洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液， 促使蛋白质分子的差速流动。 (一)凝胶色谱法 (一)凝胶色谱法 ㈠ 凝胶色谱法（分配色谱法）： 1、什么是凝胶？ 2、什么是凝胶色谱法？ 学生活动2: 3、凝胶色谱法的原理是什么？ 4、请用自己的话总结出凝胶色谱法分离相对分子质量不同蛋白质的具体过程。 由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成。 如H2CO3/NaHCO3，醋酸/醋酸钠，NaH2PO4/Na2HPO4等 缓冲溶液－－洗脱剂 组成： 配制： 作用： 调节缓冲剂的比例，可配制不同pH的缓冲液。 抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持 pH稳定。 （二）、缓冲溶液 1 、什么是电泳？ 2、 影响电泳迁移速度的因素有哪些？ 学生活动4: 4、电泳分离各种分子的原理是什么？ （三）、电泳 3、 如何消除电荷对电泳迁移速度的影响？ 5 、请描述电泳的过程？ 2．凝胶电泳法： （1）原理： 不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同， 在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同， 导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。 影响蛋白质分子运动速度的因素 (三)电泳 1.电泳的概念 指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程. 影响蛋白质分子运动速度的因素 ? 决定 运动方向 形成 库仑力 形成 阻力 决定 运动速率