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运用染色质免疫沉淀技术筛选AP-2α的靶基因1 贺爱兰, 肖湘文, 孙一兵, 刘如石, 胡翔, 周建林, 张健 湖南师范大学生命科学学院蛋白质化学与发育生物学教育部重点实验室,长沙（410081 ） E-mai ：zhangjian@. 摘 要：在后基因组时代，DNA-蛋白质的相互作用是研究基因表达调控的一个重要领域。 染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay, 简称ChIP ）是目前唯一研究体内 DNA 与蛋白质相互作用的方法。本实验运用ChIP 实验来筛选转录因子activator protein-2alpha( AP-2α)的未知靶基因。 关键词：染色质免疫沉淀技术；靶基因；AP-2α 中图分类号：Q7 1．引 言 真核生物的基因组DNA 以染色质的形式存在。因此，研究蛋白质与DNA在染色质环境 下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。染色质免疫沉淀技术是目前唯一研 究体内DNA与蛋白质相互作用的方法[1] 。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－ DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉 淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从 而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。染色质免疫沉淀技术有两类：NCHIP和XCHIP[2] 。 NCHIP一般用于组蛋白与DNA 的分析；XCHIP一般用于转录因子与DNA 的分析。本实验以 AP-2α研究对象，摸索XChIP 的最佳实验条件，并尝试利用ChIP克隆方法，以期找出目前尚 未知的AP-2α所调控的下游靶基因。 2 ．材料与方法 2.1 材料 原核表达载体 pUC-19 购自Clontech 公司，各种限制性内切酶、T4DNA连接酶、T4 DNA 聚合酶，Allkaline Phosphatase （BAP ）购自 TaKaRa ，T4多聚核苷酸激酶购自 Biolabs ， ChIP 试剂盒购自Upstate ，AP-2α抗体购自 Santa Cruz Biotechnology 。MDA-MD-453细胞系 和感受态大肠杆菌DH5α由实验室保存． 2.2 方法 2.2.1 细胞培养 MDA-MD-453细胞在 37 ℃，5% CO2 ，相对湿度 95%条件下，用完全培养液DMEM （补 加10 % 新生牛血清、2 mol/L 谷氨酰胺和 100 mg/L 青霉素和 100 mg/L 链霉素）在培养。 2.2.2 原核表达载体 pUC-19 的处理 原始的pUC-19载体，用Hinc Ⅱ单酶切，形成平末端的线性载体，酶切效果验证后再用 Allkaline Phosphatase （BAP ）进行去磷酸化，以确保载体不能自连。 2.2.3 染色质免疫沉淀实验 1本课题得到教育部长江学者和创新团队发展计划项目(IRT0445)和高等学校博士学科点专项科研基金 (20040542008)的资助。 - 1 - 用EZ ChIP™ 试剂盒 (Upstate) 来做染色质免疫沉淀反应实验. MDA-MB-453 细胞用 甲醛交联，然后细胞裂解，超声。DNA-蛋白质的混合物用 AP-2α 抗体(Santa Cruz Biotech) 进行免疫沉淀反应。经过清洗，洗脱，逆交联，最后得到纯化的 ChIP-DNA 片段。总之， 染色质免疫沉淀实验的流程按照 Upstate公司试剂盒提供的方法进行。 2.2.4 pUC19-ChIP-DNA 重组载体的构建 利用T4 DNA 聚合酶将ChIP-DNA 片段补平，然后用T4多聚核苷酸激酶将平末端磷酸 化。最后利用T4DNA连接酶将磷酸化的平末端的ChIP-DNA 片段连入已去磷酸化的平末端 的pUC-19载体，形成pUC19-ChIP-DNA