酶标仪分析原理.docVIP

酶标仪分析原理酶标仪酶免疫分析是基于酶催化反应的特性来进行检测和定量分析免疫反应。在实践上，首先要让酶标记的抗体或抗原与相应的配体（抗原或抗体）发生反应，然后再加入酶底物。酶催化反应发生后，可通过检测下降的酶底物浓度或升高的酶催化产物浓度来达到检测或定量分析抗原抗体反应的目的。 ??? 一、酶免疫分析的基本原理酶是一种能催化化学反应的特殊蛋白质，其催化效力超过目前所有的人造催化剂，一般可使反应加速108一1010倍。此外，酶还具有高度的专一性，即每一种酶只催化一种或一组密切相关的化学反应。EIA是将酶催化的放大作用与抗原、抗体的免疫反应相结合的一种微量分析技术。酶标记抗体或抗原后，既不影响抗体或抗原的免疫反应特异性，也不改变酶本身的催化活性，即在相应的反应底物参与下，标记的酶可以使底物基质水解而呈色，或使供氢体由无色的还原型转变为有色的氧化型，这种有色产物可以通过肉眼、光学显微镜或电子显微镜进行观察，也可以用分光光度计加以测定。呈色反应显示了反应体系中酶，即被标记的抗体（或抗原）的存在，从而证明发生了相应的免疫学反应。因此，EIA是一种特异而敏感的检测技术，可以在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，也可以在微克、甚至纳克水平上对其进行半定量、定量测定。 ??? 二、酶免疫分析方法中的主要组成部分 ??? （－）固相载体非均相EIA免疫实验所用的固相载体应具备以下条件：①可结合抗体（抗原）的容量大、种类多；②可将抗体（抗原）牢固地固定在其表面，虽经长期保存和多次洗涤也不脱落；③不影响所固定抗体（抗原）的免疫反应性；④抗体的Fc段（或抗原）被固定在载体上时其与抗原（抗体）的结合空间位点应朝向反应液。常用的材料有：1．塑料如由聚苯乙烯或聚氯乙烯制成的微孔反应板（48孔、96孔）或小珠、小试管等产品，是目前应用最广、最普及的一种固相载体，主要通过非共价键吸附抗原或抗体。该类载体的应用可以简化整个EIA的操作步骤，使之易于实现自动化。2、可磁化颗粒或琼脂糖珠这类固相载体通过共价键结合抗原或抗体，在检测中可分散到整个反应混合液中，有很大的表面积，结合容量较大，因此结合较为有效，使免疫反应得以迅速进行；但制备固相抗体有较严格的技术要求。 ??? （二）包被蛋白经过纯化后，大部分抗原、抗体都可作为ELA反应的包被蛋白。抗原或抗体的浓度高，吸附在载体表面的也越多。 ??? （三）待测样品EIA中的待测样品可以为细胞、血清、脑脊液、胸腹水及其他体液中的任何抗原、抗体，某些反应，如间接法检测丙型肝炎病毒抗体（抗-HCV）、竞争抑制法检测乙型病毒性肝炎核心区外型抗体（抗-HBcIgG）等需要对待测样品进行稀释后再进行分析. ??? （四】酶标记物酶标记物是指将酶通过某些化学物（交联剂）和抗原、抗体、Fab片段等蛋白结合在一起的复合物，利用该复合物可以检测相对应的免疫反应原性蛋白。目前常用的交联剂有：戊二醛、氟二硝基苯、过碘酸钠等。 ??? （五）各种缓冲液如：包被液、封闭液、稀释液、洗液、显色底物和缓冲液、终止液等。