小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验.doc

生物检测技术实验安排 实验五 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验 目的要求 掌握活细胞检测的原理和操作方法 原理 吞噬细胞包括血液中的中性粒细胞、单核细胞和组织中的巨噬细胞。当与颗粒物质(如)混合孵育一定时间后，颗粒物质被吞噬涂片染色镜检。根据吞噬率和吞噬指数可反映该细胞的吞噬功能。 Giemsa染液（吉姆萨粉末0.5g先溶于少量甘油，研磨30min，至看不见颗粒止，再将全部33mL剩余甘油倒入，于56℃温箱内保温1-24h。然后加入甲醇33mL，搅匀，保存于棕色瓶。此母液放入冰箱可长期保存，保存时间越长越好。临用时用pH 6.8的磷酸盐缓冲液稀释10倍。） 显微镜，1、5、10 ml注射器 各2支，滴管15支，载玻片一盒，恒温水浴锅，恒温箱，大平皿6-10个 4.步骤 1）鸡红细胞制备 无菌采集血（1%EDTA），1：5加生理盐水，洗涤备用。 （试验前24 h预先于小白鼠腹腔注射5%淀粉液1ml后轻柔腹部,以刺激小白鼠腹腔巨噬细胞渗出） 2）细胞吞噬 受试小鼠腹腔注射20%鸡红细胞悬液1mL, 轻柔腹部,30min后。 3）巨噬细胞获取 向腹腔注射L生理盐水，再揉一揉，使腹腔液稀释3分钟,将其仰位固定于鼠板上,正中剪开腹壁皮肤。 4）细胞涂片 吸腹腔洗液1mL,滴几滴于2张载玻片上, 置37℃温育30 min。用生理盐水漂洗, 晾干。 5）固定 以1: 1丙酮甲醇溶液固定。 6）染色与观察 Giemsa染色10min,（染色步骤： (1)自然干燥的细胞涂片(预先滴加甲醇固定更好)水平置于染色架上。 (2)将I液(用缓冲液或蒸馏水5-10倍稀释)滴盖涂片上，lO-30分钟。 (3)倒弃涂片上的I液，自来水漂洗干净。 (4)立即滴盖Ⅱ液(用缓冲液或蒸馏水5-10倍稀释)在涂片上染色10-30分钟。 (5)倒弃涂片上的Ⅱ液，自来水漂洗干净。 (6)趁湿加盖片或待干后镜检。） 用蒸馏水漂洗晾干, 油镜下每片计数100 个巨噬细胞,观察记录吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数及被吞噬的鸡红细胞数。 7）计算吞噬率和吞噬指数。 5．结果 计算吞噬百分率和吞噬指数。 吞噬百分率(%) = (吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的巨噬细胞数)×100 吞噬指数= 被吞噬的鸡红细胞总数/计数的巨噬细胞数 注意观察鸡红细胞被消化的程度： 1、未消化 鸡红细胞核清晰, 着色正常, 胞质浅红色或浅黄绿色, 胞核紫红色。 2、轻度消化 鸡红细胞胞质深黄绿色, 核固缩, 紫红色。 3、重度消化 鸡红细胞核模糊, 核肿胀, 染色淡, 胞质浅染, 胞核呈浅灰黄色。 4、完全消化 鸡红细胞核溶解, 染色极淡, 巨噬细胞内只见形状类似鸡红细胞大小的空泡, 边缘整齐, 胞核隐约可见。 实验六 食品沙门氏菌PCR 检测 目的 掌握PCR扩增的原理和方法 原理 在模板、引物、4种dNTP和赖热DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。每一循环包括高温变性、低温退火、中温延伸三步反应。每一循环的产物作为下一个循环的模板，如此循环30次，介于两个引物之间的新生DNA片段理论上达到230拷贝（约为109个分子）。Fimy1 5-GAGTTACTGAACCAACAGCT -3 ，Fimy2 5-GCCGCTAAACTACACGATGA -3 片段516bp），Goldview染料，肉汤（LB）培养基，灭菌生理盐水，无菌水，琼脂糖，TBE，PCR仪，电泳仪，成像仪，照相机。 方法 样品采集 菌种分离培养 将 25 g 样品放入 225 mL 无菌生理盐水中浸泡取 5 mL 加入 45 mL肉汤（LB）培养基中培养 5 h. DNA提取 煮沸裂解法。取1mL菌液于1.5mL离心管,12000r/min离心1min,弃上清;去离子水洗2次,再用100LL去离子水重悬;煮沸10min,12000r/min离心1 min,取上清作为模板。 PCR 扩增 取DNA 1ul模板进行 PCR 扩增（PCR反应条件: 94℃预变性5min;94℃变性30s,54℃退火30s,72℃延伸30s,经30个循环;最后72℃延伸5m 扩增产物电泳检测 扩增产物于1%琼脂糖凝胶中电泳,观察结果。 结果 阳性样本 见516 bp的目的片段。阴性无条带。 2011.4.18.