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reporter：;V(D)J Recombination;V(D)J重组; 重组激活基因（RAG）是在编码免疫球蛋白和T细胞受体分子的基因的重排和重组中起重要作用的酶。它有两种称为RAG-1和RAG-2的重组激活基因产物，其细胞表达在其发育阶段限于淋巴细胞。RAG-1和RAG-2对于产生成熟B和T淋巴细胞是两种细胞类型是必需的。;高迁移率族蛋白是存在于真核细胞核内的非组蛋白染色体结合蛋白，因其在聚丙烯酞胺凝胶电泳(PAGE)中迁移速度快而得名。HMGB1是一个含有215个氨基酸残基的单链多肽，高度保守，N端富含带正电荷的赖氨酸，C末端富含带负电荷的天冬氨酸和谷氨酸，又称酸性尾巴，分子量约为24894 Da。从氨基端到羧基端的结构依次为A box，B box和仅含谷氨酸和天冬氨酸残基的受体结合模体。;Tethered particle motion;;fig.2;;fig.4;fig.5;We observe that HMGB1 alters the reduction in DNA tether length for RAG1/2c alone from 64 ± 5 bp and 57 ± 5 bp for a single 12RSS and 23RSS to 101 ± 8 bp and 132 ± 4 bp, respectively.;fig.6;C;fig.7;fig.8;结合动力学显示RAG-RSS复合物的平均停留时间。; 我们观察到在没有HMGB1的情况下通过RAG的RSS结合的DNA长度的明显减少，这与先前的工作一致，显示单独的RAG蛋白在RSS处弯曲DNA。这种计算提供了RAG-RSS交互的Kd。我们期望，我们的单分子方法可用于测量非共有RSS的Kd值，从而提供对RSS和RAG活性之间的关系的更完整的理解。 该方法还允许首先测定RAG1 / 2c复合物结合到12RSS或23RSS的平均停留时间。 我们发现RAG1 / 2c-RSS复合物是相当稳定的，停留时间在几分钟的量级。 特别地是，我们发现，与23RSS（?230s）相比，复合物在12RSS（?430s）处保持更长的结合时间，与两个位点之间的Kd的差异一致;; 我们发现HMGB1增加RAG-RSS复合物中DNA长度的减少量。 这种观察结果与在12RSS-RAG-HMGB1或23RSS-RAG-HMGB1复合物中检测到的大弯曲的HMGB1依赖性一致，尽管那些研究使用短的寡核苷酸底物。 我们还使用这种DNA链系长度的减少量来确定在RAG1 / 2c和HMGB1存在下12RSS和23RSS的Kd，并且发现HMGB1与单独的RAG1 / 2c相比降低了两个Kd值，并且它们是相似的，与前面的观察一致。我们研究HMGB1依赖过程的单分子实验可以扩展到研究除RAG1 / 2c以外的其它可以与DNA结合并且可以被HMGB1促进的蛋白质（例如，肿瘤抑制蛋白p53）。; 在我们实验中使用的RAG1 / 2c和HMGB1的浓度下，在HMGB1存在（或不存在）下与RAG1 / 2c相关的结合事件相对频繁，但是该结合（配对复合物形成）的下游产物相对稀少 ; 在我们的实验中，珠子结合到DNA上在配对的复合物状态中仅花费总观察时间的4％。 我们直接观察到在DNA底物上存在12RSS和23RSS时配对复合物的形成。 当仅存在12RSS（或不存在RSS）时，我们没有看到复合物形成的证据，并且我们确认当使用1,200和1,800-bp间距时配对复合物时的表观长度与已经被缩短了12/23的信号间距的系链一致。我们无法确定是否一个或两个RSSs在配对的复杂形成之前被占领， 我们需要进行更多的研究来解决这个重要机制问题。; 最后，我们通过观察珠子释放推断发夹结构的形成作为研究RAG-HMGB1-RSS介导的DNA上的切割。在这些实验中，我们证实了珠释放和RAG1 / 2c和HMGB1的浓度之间的关系。我们发现珠粒释放在含有12RSS / 23RSS对的底物上被显着增强，需要催化活性RAG，并且当信号间距离缩短超过以前显示抑制RAG介导的切割时V（D） J重组。利用这些工具，现在可以对V（D）J反应过程进行大量的系统研究是有可能的。我们的结果已经显示，大量的RSS和它们的序列可能改??重组动力学，并且对确定在淋巴发育期间产生Ig和TCR基因的各种12/23规则调节的V，D和J反应的突触和发夹形成的定量规则是有很大意义的。;Thank You