从毛霉中提取蛋白酶.docVIP

实验一：从毛霉中提取蛋白酶及分离方案 组员：周云线 周丽玲 陆江妙 1 实验原理 毛霉又叫黑霉、长毛霉接合菌亚门接合菌纲毛霉目毛霉科真菌中的一个大属。以孢囊孢子和接合孢子繁殖菌丝无隔、多核、分枝状，在基物内外能广泛蔓延，无假根或匍匐菌丝在高温、高湿度以及通风不良的条件下生长良好常出现在酒药中，能糖化淀粉并能生成少量乙醇，产生蛋白酶，有分解大豆蛋白的能力，我国多用来做豆腐乳、豆豉。许多毛霉能产生草酸、乳酸、琥珀酸及甘油等，有的毛霉能产生脂肪酶、果胶酶、凝乳酶等利用其蛋白酶以酿制腐乳、豆豉等皮革工业的脱毛和软化已大量利用蛋白酶，既节省时间，又改善劳动卫生条件。蛋白酶还可用于蚕丝脱胶、肉类嫩化、酒类澄清。 蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。 称取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水1000m煮沸半个小时或高压蒸煮20分钟，纱布过滤，再加10-20g葡萄糖和17-20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，每试管约5-10m（视试管大小而定），121）灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。 试剂 0 1 2 3 4 5 6 7 8 标准络氨酸溶液/mL 0 1 2 3 4 5 6 7 8 蒸馏水/mL 10 9 8 7 6 5 4 3 2 稀释络氨酸溶液浓度/(μg/mL） 0 10 20 30 40 50 60 70 80 从上述各试管中各取1mL,分别加入5mL0.4mol/L碳酸钠溶液、1mL福林-酚试剂，于40℃水浴中显色20min,在680nm波长下测定吸光度，绘制标准工作曲线，在标准曲线上求得吸光度为1时相当于的络氨酸质量（μ）μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。 ② 样品中蛋白质含量的测定 取1支具塞试管，准确加入0.l ml样品提取液，再加入0.9 ml蒸馏水，5ml考马斯亮蓝试剂，充分混合，放置2min后，以标准曲线1号试管做参比，在595 nm波长下比色，记录吸光度。然后利用标准曲线求出样品蛋白质含量把透析袋剪成适当长度（10-20cm）的小段。 在大体积的2%(W/V)碳酸氢钠和 1mmol/L EDTA(pH 8.0)中将透析袋煮沸10分钟用蒸馏水彻底清洗透析袋。 放在 1mmol/L EDTA(pH 8.0)中将之煮沸10分钟。冷却后，存放于4度，必须确保透析袋始终浸没在溶液内。从此时起取用透析袋是必须戴手套。用前在透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净。使用时，一端用橡皮筋或线绳扎紧，也可以使用特制的透析袋夹夹紧，由另一端灌满水，用手指稍加压，检查不漏，方可装入待透析液，通常要留三分之一至一半的空间，以防透析过程中，透析的小分子量较大时，袋外的水和缓冲液过量进入袋内将袋涨破。含盐量很高的蛋白质溶液透析过夜时，体积增加50％是正常的。为了加快透析速度，除多次更换透析液外，还可使用磁子搅拌。透析的容器要大一些，可以使用大烧杯、大量筒和塑料桶。小量体积溶液的透析，可在袋内放一截两头烧园的玻璃棒或两端封口的玻璃管，以使透析袋沉入液面以下。