棉铃虫HaCHS和CDA基因的克隆、表达及FeedingRNAi分析.pdfVIP

摘 要  摘 要 棉铃虫（Helicoverpa armigera ）是棉花的重要害虫，采用种植Bt棉和化学方 法进行防治导致害虫出现抗性等一系列问题。RNAi技术因具有特异和高效的特 点，而成为新型的害虫防治策略。靶基因的选择是成功的重要关键之一。几丁质 是昆虫表皮和围食膜的主要成分之一，植物和高等动物中不存在；其代谢是昆虫 的重要生化代谢过程之一。因此几丁质代谢相关基因有可能是RNAi技术防治害 虫的理想靶标，具有重要的研究价值。 本研究以棉铃虫体内的几丁质代谢相关基因CHS和CDA作为靶标基因，对其 进行基因克隆和表达特征分析，并采用RNAi技术对其表型进行分析。从而为实 现棉铃虫的有效控制提供科学依据。具体内容如下： 1. 棉铃虫几丁质合酶基因的克隆与表达分析 通过RT-PCR 技术首次在棉铃虫克隆出两个几丁质合酶基因：HaCHS1 和 HaCHS2 ；并得到了HaCHS1 的两个剪接变体，分别命名为HaCHS1A和HaCHS1B 。 HaCHS1 的两个交替外显子序列，只有177 bp的差异，核苷酸和氨基酸水平上相 似度分别为64%和69% 。HaCHS1读码框4698 bp ，编码1565个氨基酸；HaCHS2 读码框4587 bp ，编码l528个氨基酸。RT-qPCR结果显示：HaCHS2只在肠道表达， 在前肠中表达量最高，其次是中肠和后肠，而在其他组织则表达量极低； HaCHS1A主要在表皮中高表达，前肠和后肠也检测到少量的表达，而HaCHS1B 在表皮，前肠和后肠中都高表达。HaCHS1A和HaCHS1B在幼虫期，蛹期和蛾期 都有表达，其中蛹期表达量最高；而HaCHS2基因在卵期和幼虫期表达量高。 2. 棉铃虫几丁质脱乙酰基酶2基因的克隆与表达分析 克隆了棉铃虫四个几丁质脱乙酰基酶基因（HaCDA1 ，HaCDA2 ，HaCDA5a 该基因ORF为1611 bp，编码536个氨基酸， 和HaCDA5b ），其中HaCDA2 为新基因， 推测的蛋白分子量约为60.78 kDa，理论等电点为5.31 。基于序列比对以及系统发 育确认HaCDA2基因属于几丁质脱乙酰基酶1家族。RT-qPCR检测发现：HaCDA2 基因只在脂肪体高表达；HaCDA2基因在幼虫期和蛹期表达量高。 3. 目的基因RNAi干扰效率检测及表型观察 分别构建表达HaCHS 、HaCDA 的dsRNA 的载体；用表达dsRNA （HaCHS1 、 HaCHS1A 、HaCHS1B 、HaCHS2 、HaCDA1 、HaCDA2 、HaCDA5a和HaCDA5b ） I   摘 要 的HT115菌液喂食。RT-qPCR检测喂食处理2 d 的幼虫发现，棉铃虫的靶标基因表 达量都出现了下调，但是下降的幅度不同 （以对照为100%，分别为73.1%、23.8% 、 14.0%、8.3%、82.9%、79% 、38% 、和51% ）。在肠道有所表达的基因比非肠道 基因沉默效率高。此外与对照组相比，dsCHS1、dsCHS1A、dsCHS1B、dsCHS2、 dsCDA5a和dsCDA5b进行的饲料添加和叶片涂抹实验处理后，均可以在一定程度 上抑制棉铃虫的生长发育；在棉叶上涂抹表达这些基因dsRNA 的菌液，可以增加 叶片对幼虫的抗性。 以上研究将为以HaCHS ，HaCDA5a和HaCDA5b基因为靶标的棉铃虫的防治 提供科学依据。 关键词 棉铃虫 几丁质合酶 几丁质脱乙酰基酶 RNAi II     Abstract Abstract Helicoverpa armigera is a major pe