短棒状杆菌胞壁肽聚糖的实验探究.pdfVIP

短棒状杆菌胞壁肽聚糖的实验研究 杨琳，夏天瑶，白春杰，闫素志， 耿星海， 何玉君 (长春生物制品研究所吉林长春130062) 摘要：目的提取短棒状杆菌的有效成分，观察生物学效应，为研制新型治疗制荆奠定基础．方法将 短棒状杆菌77-I株用冷热外压法获得细胞壁，再经苯酚及三氯甲烷萃取肽聚糖成分．结果提纯品 经紫外吸收测定、淋巴细胞转化试验、抑瘤试验、脾激活试验、毒性试验证实，具有生物学活性及 安全性．其主要成分经生化检测含有多肽及聚糖类物质．结论短棒状杆菌的有效成分是细胞壁上的 肽聚糖类物质；实验采用的提纯工艺具有可操作性和实际应用价值，为新产品开发提供了可靠依据． 关键词：短棒状杆菌；细胞壁；肽聚糖；萃取；抗肿瘤；生物学活性 短棒状杆菌制剂(CPP)作为一种非特异性免疫调：宵制剂，在临床应用已有20余年，主要用于治 疗各种免疫缺陷病，如：癌症、癌性胸水、黑色素瘤、牛皮癣、再生障碍性贫血、女阴白斑、感染 性哮喘等111。它的抑瘤作用及免疫调节作用已被临床医生及专家学者所公认，但因其是全菌体制剂， 临床使用常出现注射局部肿痛、硬结，发热持续2周，血相异常等不良反应，这些副作用使该产品 大规模应用受到一定限制。鉴于此，国内外专家学者正在探索保留有效成分的提纯方法。已有资料 证实，它的有效成分为细胞壁骨架或细胞壁上的肽聚糖12·31，但研究者提供的的工艺路线多采用超 声破菌体、酶切和连续流离心法【4l还有人将菌体用超高压射流对撞机破碎制成纳米级制剂15·61，这 些制造方法工艺繁杂，成本高、耗材大，不适合工业化生产，至今未形成产品上市。作者经过实验， 初步探索到一种成本低廉、简便易行的制造工艺，并证实了提纯品的生物学效应，现报道如下： 1．材料 1．1短棒状杆菌 骨骨髓：原始种子批由中国药品生物制品检定所分离鉴定，定名为77．1株；主种子批和工作种子批， 由本所传代扩增并冷冻干燥。 1．2培养基质 碎肉半流体、肝硫乙醇酸钠、肝透析液培养基均由本所培养基室制造。 1．3化学药品及试剂 苯酚、三氯甲烷， 北京化工厂， 分析纯；四甲基偶氮唑盐(Mm。济南爱博生物工程公司； 蛋白质标准品， 中国药品生物制品检定所； 菌种鉴定用生化培养基， 北京路桥生化制剂厂。 1．4实验设备 J6B型离心机，美国贝克曼公司：UV8500型紫外分光光度计，上海天美仪器厂；DG3022A 型酶标检测仪，华东电子管厂：H600．A型电子显微镜，日本日立公司。 1．5实验动物 Balb／c纯系小鼠， 本所实验动物室。合格证号：0002660 2．方法 2．1CP细胞璧的提取 启开CP菌种．按‘中国生物制品规程》2000年版要求，进行菌种生化反应鉴定。合格后，分 310 别在碎肉、卜流体培养基、硫乙醇酸盐培养基、肝透析液培养基上传一、二、三代进行扩增培养，最 后接种丁．肝透析液人瓶中于3637C厌养培养6d。菌液以终浓度为0．5％的福尔马林灭活。离心收集 菌体，以生理盐水稀释成含菌1．0×10¨／ml。用冷热外压法处理获取细胞肇，并通过电镜观察凶体脱 细胞壁的情况。 2．2胞壁肽聚糖的制备 将收集的细胞壁成分用O．1％八羟喹林．90％热苯酚萃取一次，再以三氯甲烷进行二次萃取，所 得提纯物经进一步处理，除菌过滤即得肽聚糖制剂(PGP)。 2．3检测 2．3．1短棒状杆菌菌体的特性鉴定在灭活及脱细胞壁之前，分别接种培养到期的短棒状杆菌菌液 于葡萄糖、棉子糖、麦芽糖、蔗糖、液化明胶、靛基质、硝酸盐等7种微量生化管上，参见《中国 Nl 药典》2005年三部附录X7】进行生化反应测定。 高吸收值。 2．3．3提纯品多肽及总糖含量测定肽含量测定采用福林．酚法，制作标准曲线，在650nm处测定在 吸收值，在曲线上求得肽含量。糖含量测定采用3，5二硝基水杨酸比色定糖法，以无水葡萄糖作标 准溶液，在520nm处测定吸收值，由回归方程中求得总糖含量。 射活的艾氏腹水瘤细胞(5．O×106／mL)0．2mL，于注射瘤细胞前ld及次日起，CPP组腹腔注射 CP 0．25mL(含短棒状杆菌1．5×109)，PGP组腹腔注射POP 0．25mL(含：1．25rag多肽：150ug总 糖)；对照组注