第三章动物细胞工程制药23节.ppt

可感染人和畜 、禽的一种 DAN 病毒 。某 些型的人腺病毒接种新生的鼠可诱生肿瘤，在医学和兽医学 上都有研究价值。病毒粒外形呈立体对称的二十面体，直径 70 ～ 90 纳米 ，无包膜。人腺病毒可在人胎肾及多种人的传 代 细胞 中繁殖。  ????????????????????????? 腺病毒的电镜照片 腺病毒 腺病毒晶体 腺病毒载体的优点：1. 宿主范围广, 对人致病性低? ? 腺病毒载体系统可广泛用于人类及非人类蛋白的表达。腺病毒可感染一系列哺乳动物细胞，因此在大多哺乳动物细胞和组织中均可用来表达重组蛋白。特别需要指出的是：腺病毒具有嗜上皮细胞性，而人类的大多数的肿瘤就是上皮细胞来源的。另外，腺病毒的复制基因和致病基因均已相当清楚，在人群中早已流行（70-80%成人体内都有腺病毒的中和抗体存在）。人类感染野生型腺病毒后仅产生轻微的自限性症状，且病毒唑治疗有效 2. 在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因? ? 逆转录病毒只能感染增殖性细胞，因此DNA转染不能在非增殖细胞中进行，而必须使细胞处于持续培养状态。腺病毒则能感染几乎所有的细胞类型，除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤细胞。腺病毒是研究原代非增殖细胞基因表达的最佳系统，它可以使转化细胞和原代细胞中得到的结果直接进行对比。 3. 能有效进行增殖，滴度高? ? 腺病毒系统可产生1010到1011VP（viral particles 病毒颗粒）/ml，浓缩后可达1013VP/ml，这一特点使它非常适用于基因治疗 4. 与人类基因同源? ? 腺病毒载体系统一般应用人类病毒作为载体，以人类细胞作为宿主，因此为人类蛋白进行准确的翻译后加工和适当的折叠提供了一个理想的环境。大多数人类蛋白都可达到高水平表达并且具有完全的功能 5. 不整合到染色体中，无插入致突变性? ? 逆转录病毒可随机整合到宿主染色体，导致基因失活或激活癌基因。而腺病毒则除了卵细胞以外几乎在所有已知细胞中都不整合到染色体中，因此不会干扰其它的宿主基因 6. 能在悬浮培养液中扩增? ? 293细胞可以适应悬浮培养，这一调整可使病毒大量扩增。大量事实证明悬浮293细胞可在1～20L的生物反应器中表达重组蛋白 7. 能同时表达多个基因? ? 这是第一个可以在同一细胞株或组织中用来设计表达多个基因的表达系统。最简单的方法是将含有两个基因的双表达盒插入腺病毒转移载体中，或者用不同的重组病毒共转染目的细胞株来分别表达一个蛋白。测定不同重组病毒的MOI比值可正确估计各重组蛋白的相对共表达情况。 正是由于具有以上一些优点，腺病毒被极其广泛地应用于体外基因转导、体内接种疫苗、和基因治疗等各个领域。 杆状病毒 用杆状病毒做载体有许多优点： （1）该病毒基因组是双链DNA，容易进行重组； （2）插入7~8kb的DNA不影响正常病毒粒子的形成； （3）多角体蛋白和病毒粒子的形成无直接关系，因此用外源基因更换多角体蛋白基因，仍能形成有感染力的病毒粒子； 用杆状病毒做载体有许多优点： （4）多角体蛋白基因有非常强的启动子，产生的蛋白质可占全部蛋白质的20~30%； （5）用光学显微镜可看到多角体，容易以此为标记物来挑选阳性克隆； （6）如果用家蚕杆状病毒，还可在蚕体直接表达外源基因 1、真核细胞基因表达载体的构建 另一类是质粒载体，而且常常是穿梭质粒载体，即在细菌和哺乳动物细胞两者体内都能扩增 构建此类载体一般含有如下基本成分： 1、真核细胞基因表达载体的构建 （1）允许载体在细菌体内扩增的质粒序列 多数含有质粒pBR322或其衍生载体pAT153的序列，包括能使质粒在细菌体内复制的起始位点和抗生素标记基因 （2）含有能使基因转录表达的调控元件，在5’端转录起动需要有启动子，包括帽状位点（RNA转录起始点）上游约30碱基处的TATA框和上游70~90碱基处的CAAT框序列和增强子。当前构建载体的许多启动子序列都来自病毒。也有其它来源的启动子。此外，在基因3’端应有终止序列、RNA 3’端的切割序列和poly A序列等。 1、真核细胞基因表达载体的构建 1、真核细胞基因表达载体的构建 （3）能用以筛选出外源基因已整合的选择标记 一般有两类标记：一类仅适合用于密切相关的突变细胞株，如采用标记基因hgprt、tk和aprt等基因，它们仅适用于hgprt--（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶）、tk--（胸腺嘧啶脱氧核苷激酶）和aprt--（腺嘌呤磷酸核糖基转移酶）等基因缺失的细胞株。另一类是显性作用基因，如neo基因，它能使氨基糖苷抗生素—新霉素磷酸化而失活，从而使原来对新霉素敏感的哺乳动物细胞一旦获得含该基因的载体后，就能在含该抗生素的培养基中存活