绵羊无浆体和牛无浆体实时荧光定量PCR检测方法的建立.pdfVIP

绵羊无浆体和牛无浆体实时荧光定量PCR 检测方法的建立 摘 要 无浆体（Anaplasma ）是一类经蜱传播的专性细胞内寄生菌，主要寄生于牛羊等反 刍动物的血细胞中，其引起的疾病被称为无浆体病。已知的无浆体病原包括边缘无浆体 （A. marginale ）、绵羊无浆体（A. ovis ）、中央无浆体（A. centrale ）、牛无浆体（A. bovis ）、 嗜吞噬细胞无浆体（A. phagocytophilum ）和扁平无浆体（A. platys ）。建立高效快速准 确的诊断方法，对于该病的防控具有重要作用。实时荧光定量PCR 技术具有特异性强、 灵敏度高、重复性好、定量准确、自动化程度高、速度快、全封闭反应等优点，使其很 快成为疾病检测和诊断的热点技术。目前，国内外均未有检测绵羊无浆体和牛无浆体实 时荧光定量PCR 方法的报道。 利用实验室保存的 12 株绵羊无浆体的gltA 基因进行克隆测序。然后根据获得的绵 羊无浆体和GenBank 上其他相近病原体的gltA 基因序列设计出针对绵羊无浆体的实时 荧光定量引物和探针，建立了一种检测绵羊无浆体的实时荧光定量 PCR 方法。该方法 特异性强，与相近病原如边缘无浆体、牛无浆体、嗜吞噬细胞无浆体、支原体、衣原体、 螺旋体、巴贝斯虫（新疆分离株）和吕氏泰勒虫无交叉反应。检测灵敏度约10 拷贝/μL。 该方法具有较好的稳定性，组内试验和组间试验Ct 值变异系数分别在在 0.26 ％-0.97 ％ 和0.42%-1.5%。对野外采集的254 份山羊血液样品分别使用该方法和普通PCR 方法进 行检测，阳性率分别为25.6%和9.06%，结果表明实时荧光定量PCR 方法具有更高的敏 感性。建立的绵羊无浆体实时荧光定量PCR 方法可以有效检测绵羊无浆体感染。 根据GenBank 上牛无浆体及其他相近病原体16S rRNA 基因序列设计出针对牛无浆 体的实时荧光定量引物和探针，建立了一种检测牛无浆体实时荧光定量 PCR 方法。该 方法特异性好，与相近病原如边缘无浆体、绵羊无浆体、嗜吞噬细胞无浆体、绵羊泰勒 虫、吕氏泰勒虫、中华泰勒虫、巴贝斯虫（新疆分离株）、牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、 支原体、衣原体、螺旋体和弓形虫无交叉反应。检测灵敏度约10 拷贝/μL。该方法稳定 性好，组内试验和组间试验Ct 值变异系数分别在0.10%-1.01% 和0.61%-1.88%，对野 外采集的196 份牛和山羊血液样品分别使用实时荧光定量PCR 方法和套式PCR 方法进 行检测，阳性率分别为62.2%和56.6%，结果表明实时荧光定量PCR 方法具有更高的敏 感性。建立的牛无浆体实时荧光定量PCR 方法可以有效检测牛无浆体感染。 关键词：绵羊无浆体；牛无浆体；实时荧光定量PCR ；检测 I Development of Real-time Quantitative PCRs for detection Anaplasma ovis and A. bovis Abstract Anaplasma is a tick-borne endoglobular rickettsial pathogen of ruminants, which cause disease are called Anaplasmosis. The known pathogenes include A. marginale, A. ovis, A. centrale, A. bovis, A. phagocytophilum and A. platys . The establishment of efficient, rapid and accurate diagnostic method, has an important role in the detection and surveillence of the disease. Real-time quantitative PCR technique has the merits of specific, sensitive, repr