耶尔森强毒力岛(HPI)在禽大肠杆菌中水平转移及功能评价.pdfVIP

摘要 耶尔森强毒力岛(HPI)是发现于耶尔森菌属染色体上的成簇基因区域，具有 典型的毒力岛特征，主要包含与铁摄取有关的毒力基因簇，即耶尔森杆菌素 (yersiniabactin,Ybt，铁载体)基因及其调控基因，行使对铁的摄取功能。HPI 的结 构特征及其在肠道杆菌中的广泛分布提示其可能存在水平转移，而有关禽大肠杆 菌 HPI 在低温低铁共培养条件下的水平转移尚未见报道。有研究表明，大肠杆 菌中 HPI 主要具有铁摄取与调节功能，可赋予细菌毒力和致病性，但对于宿主 菌获得HPI 后的功能变化仍未见报道。 为探讨 HPI 在禽大肠杆菌中的分布、转移特点及其在受体菌中的功能，本 研究对禽大肠杆菌临床分离中 HPI 的分布情况进行分析；选择合适的分离株作 为 HPI 转移的供、受体，低温低铁条件下共培养后筛选转移阳性株；对比 HPI 转移前后受体菌的生物学活性变化，初步研究 HPI 在禽大肠杆菌中转移特性和 功能，为进一步明确 HPI 在大肠杆菌中的分布特性及其与禽大肠杆菌致病性的 关系提供一些基础。具体研究内容和结果如下： + 1、禽大肠杆菌临床分离株中HPI 的分布及HPI 株相关性分析 以临床分离的禽大肠杆菌的基因组DNA 为模板，设计并合成irp2、fyuA 、 intB 和ERIC 基因的特异性引物，应用所建立的PCR 方法检测临床分离株中HPI 的携带情况及各HPI 阳性株间基因型相关性，同时对比分析各HPI 阳性株中所 携带irp2 和intB 基因的相关性，结果40 株禽大肠杆菌分离株中有7 检出HPI， 阳性率为17.5%，有一株阳性株存在fyuA 缺失；对HPI 阳性株基因型相关性分 析结果显示，7 株大肠杆菌的基因型之间存在较大的差异，说明 HPI 可存在于 多个基因型的大肠杆菌中；对HPI 阳性株irp2 和intB 基因相关性分析发现，irp2 和 intB 基因总体表现出较高保守性的特点，两个基因均存在菌种间的同源性高 于种内的情况。 2 、禽大肠杆菌中HPI 的转移及其供、受体菌的研究 选择合适供、受体株，活化后按 10%的比例接种于含有0.2mM 的LB 液体 培养基中，4 ℃培养；依次用氯霉素抗性平板、irp2 基因PCR 和ERIC-PCR 方法 检测，筛选HPI 转移株；对比分析转移株与受体株基因型的差异，确定HPI 转 移的受体株；PCR 扩增转移株与供体株的intB 基因，确定HPI 转移的供体菌。 结果，从氯霉素抗性平板上检测到HPI 阳性菌落，ERIC-PCR 对比分析后发现， 该菌与受体株AE-a1 基因型相似性为100%，与其它菌株差异均在20% 以上；Int I 基因检测对比发现，该基因在AE-t 和AE-d2 中的大小相同，不同于AE-d1 。 3、HPI 的转移对受体菌生长特性和致病性影响的研究 分别从以下方面检测HPI 的转移对受体菌功能的影响：在96 孔细胞培养板 中加入LB 液体培养基，接入受试菌培养，每隔2 小时测菌液OD600 并绘制细菌 生长曲线，比较转移阳性株和受体株生长曲线的差异；取菌悬液接种于CAS 固 体平板上，培养到菌落直径不再发生变化，通过CAS 平板上的晕圈半径初步检 测菌株产铁载体的能力；在LB 培养基中加入不同剂量螯合剂，接入等量的菌液， 进行铁胁迫实验，比较两株菌的低铁耐受能力；通过检测受体株和转移株对DF-1 细胞的侵袭粘附力及其对7 日龄雏鸡的致死能力，比较两株菌的毒力差异。生长 曲线检测结果显示，AE-a1 的生长速度明显优于AE-t ；CAS 检测结果显示，AE-t 产铁载体的能力最强，高于AE-a1，也高于AE-d 1；不含有铁螯合剂的培养基中， AE-a1 的生长状况要好于AE-t ；在铁鳌合剂浓度大于等于0.128mM 的培养基中， AE-t 的生长速度均高于AE-a1，且在前24h 差异显著；细胞粘附侵袭实验和动物 毒性实验显示，AE-a1 的毒力强于AE-t 的毒力，并且差异极显著。 以上结果表明，本实验通过低温低铁共培养成功得到 HPI 转移株，且确定