高效阴离子交换色谱法测定依诺肝素钠1,6-脱水衍生物含量.pdfVIP

高效阴离子交换色谱法测定依诺肝素钠 1。6．脱水衍生物含量 王悦，李京，李颖颖，范慧红 (中国食品药品检定研究院，北京100050) 摘要：目的 建立依诺肝素钠特异性末端结构 1，6一脱水衍生物结构的含量测定方法。方法 肝素酶混合液将依诺肝素钠水 解成二糖或四糖单位，水解得到的寡糖峰经硼氢化钠还原后用一高效阴离子交换色谱法方法进行分析。采用WatersSpherisorb s5SAX(4．0mm ×250mm，5 m)色谱柱，以0．28g·L。。磷酸二氢钠溶液为流动相A含 0．28g·L 磷酸二氢钠及 140g· L 高氯酸钠的溶液为流动相B进行梯度洗脱(0～20rain，3％ ～35％B：20～50min，35％～100％B；50～60min．100％B；60～ 61min，100％ ～3％B，61～79min，3％B)，流速0．8mL·min～，柱温为50℃；检测波长为234nm，并用归一化面积百分比法计 算摩尔百分含量。结果 筛选出了酶解效果达标的国产肝素酶并优化 了酶解条件 ，酶解后 1，6一脱水 △IS—IS与 1，6-脱水 △ Is峰面积比1．15；优化色谱条件后 △IA和 1，6一脱水△IS的分离度 1．5；硼氢化钠还原后的溶液色谱图中，△IS和还原 △IS的峰面积比均小于0．02；两家国产依诺肝素钠生产企业样品结果均在 15％～25％内。结论 方法可对依诺肝素钠特征 还原末端结构进行分离和定量，作为对低分子肝素进行微观结构分析的首个鉴别项 目，已收栽入新修订依诺肝素钠国家标准 草案 中。 关键词：依诺肝素钠；1，6一脱水衍生物；高效阴离子交换色谱法；肝素酶 I；肝素酶 Ⅱ；肝素酶Ⅲ；国家标准 doi：10．11669／cpj．2014．16．021 中图分类号：R917 文献标志码 ：A 文章编号：1001—2494(2014)16—1461—06 SAXH·PLCMethodforQuantificationof1，6-AnhydroDerivativesofEnoxaparinSodium WANGYue，LIJing，LIYing—ying，FANHui—hong (NationalInstitutefo，FoodandDrugControl，Beljing100050，China) ABSTRACT：OBJECTIVE ToestablishanHPLCmethodtodeterminethelevelsofthecharacteristic1．6一anhydroderivativesof enoxaparinsodium．METHODS Theenoxaparinsodium solutionwasdepolymerizedbyamixtureofheparinasestoobtainedi—ortet． ra—saccharideunits．andtheproductswerereducedbysodium borohydrideandthenanalyzedbySAX—HPLC．Theanalysiswascarried outonaWatersSpherisorbs5SAXcolumn(4．0mmx250mm，5 m)．Tilemobilephasewascomposedof0．28g·L monobasic sodiumphosphatesolution(A)and140g ·L sodiumperchloratesolution(B)(0—20min，3％ 一35％ B；20—50rain，35％一 100％ B；50—60rain，100％ B；60—61min，100％ 一3％ B，61—79rain．3％ B)andtheflowratewas0．8mL ·min_。．Theeolnlnn temperaturewas50℃ andthedetectionwavelengthwassetat234nm．Thenormalizedareapercentagemethodwasusedforcalcula— tion．RESULTS Onedomesticheparinasefactorywasscreenedoutthatcouldpassthedepolymerizationsuitabilitytest．andtheratio ofthepeakareaofl，6-anhydro—A IS—IStothatofl，6一A ISwasnotmorethan1．15．Intheoptimalchromatographiccondition，the resolutionbetweenreducedAIAand1．6-anhydr