第二章载体21研讨.ppt

* 三、柯斯质粒载体 cosmid 一类用于克隆大片段DNA的载体 Cosmid: cos site-carrying plasmid :带有粘性末端位点(cos)的质粒，也叫粘粒 一类由人工构建的含有λ噬菌体DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体 * 将λDNA左右臂和中段都去除，仅留下两端包装噬菌体所必需的cos序列，再加上质粒的复制序列、标记基因和多克隆位点等，就可构成粘粒载体。载体大小5-7kb，故其克隆能力为45kb左右。 外源DNA插入粘粒后，可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组DNA导入大肠杆菌，但它不会产生子代噬菌体，而是以质粒DNA的复制方式在细菌中繁殖而被克隆。所以粘粒主要用于基因组文库的构建。 * 柯斯质粒载体特点 1、具有λ噬菌体的特性：体外包装，高效感染 2、具有质粒载体的特性：易于克隆操作、选择和复制扩增 3、具有较高容量：最高45kb 不能体内包装，不能裂解受体细胞，在细胞内不能形成噬菌体颗粒，因而不能形成噬菌斑 * 第三节 高容量载体及其发展方向 许多动、植物基因往往含有多个内含子，占据相当长的DNA区域。全基因组序列分析往往需要成百甚至上千kb的DNA片段，而使用普通载体通常难以获得完整的基因序列克隆。 人工染色体载体(artificial chromosome vector)：利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体。 与其他的克隆载体相比，人工染色体克隆载体的特点是能容纳长达1000kb甚至3000kb的外源DNA片段。 YAC载体含有如下元件： 酵母染色体的端粒序列 酵母染色体的复制子 酵母染色体的着丝粒序列 酵母系统的选择标记 大肠杆菌的复制子/选择标记 YAC载体的装载量800-1000kb * 酵母人工染色体载体 （Yeast Artificial Chromosome, YAC） * YAC 载体的复制元件是其核心组成成分，其在酵母中复制的必需元件包括  。 自主复制序列(autonomously replication sequences,ARS) 一段特殊的序列，含有酵母菌中 DNA 进行双向复制所必须的信号 着丝粒(centromere, CEN) 有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点, 使染色体在分裂过程中能正确分配到子细胞中 。在 YAC 中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用, 如pYAC4 使用的是酵母第四条染色体的着丝粒 端粒重复序列(telomeric repeat, TEL) 定位于染色体末端一段序列，用于保护线状的 DNA 不被胞内的核酸酶降解，以形成稳定的结构。 * 选择标记-SUP4: SUP4赭石突变抑制基因，抑制赭色表型（成为白色）。 不含外源DNA片段的YAC载体转化酵母菌，转化子的菌落成白色。 带有插入的外源DNA片段的YAC重组载体，其Sup4已经失活，结果转化酵母菌后所产生的转化子形成赭色菌落。 * 这种人工染色体载体实际上是一种“穿梭”克隆载体，含有质粒克隆载体所必备的第一受体(大肠杆菌)质粒复制起始位点(ori)，还含有第二受体(如酵母菌)染色体DNA着丝粒、端粒和复制起始位点的序列，以及合适的选择标记基因。 穿梭质粒载体（shuttle plasmid vectors）： 人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体 * 这样的克隆载体在第一受体细胞内可以按质粒复制形式进行高拷贝复制。这种克隆载体在体外与目的DNA片段重组后，转化第二受体细胞，可在转化的细胞内按染色体DNA复制的形式进行复制和传递。 筛选第一受体的克隆子，一般采用抗菌素抗性选择标记；而筛选第二受体的克隆子，常用与受体互补的营养缺陷型。 * * * * Yeast复制起点 E.coli复制起点 E.coli选择标记 Yeast选择标记 MCS 大肠杆菌?枯草杆菌穿梭载体 大肠杆菌?酿酒酵母穿梭载体 大肠杆菌?动物细胞穿梭载体 常用的穿梭质粒载体 * 穿梭载体的优点 ② 也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达。 ③ 可以自如的在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。 克隆、构建 表达 E.coli Animal cell ① 利用大肠杆菌进行基因克隆 * 由于酵母染色体是线性的，因此其在工作状态也是线状的。但是，为了方便制备YAC载体，以环状的方式存在。 BamHI 酶切位点 * 酵母人工染色体构建基因组文库 * 一些弊端: 在 YAC 载体的插入片段会出现缺失和基因重排 容易形成嵌合体。即在单个 YAC 中的插入片段由两个或多个独立的基因组片段连接组成。嵌合克隆约占总克隆的