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1基因克隆

(2) 克隆载体 复制基因(replicator) 选择性记号 克隆位点 vector 4.1.3 基因文库 定义:基因组文库(gene library):将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段,并与合适的载体重组后导入宿主细胞,进行克隆。这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合,即基因组文库,它包含了该生物的所有基因。 基因组DNA文库 限制性内切酶 基因组DNA 基因重组 转化细菌 体外包装 特点及应用: 包含所有遗传信息 构建难度大(单拷贝基因、长片段基因) 筛选难度大 用于研究基因在基因组中的情况 3、构建cDNA文库,筛选目的基因 cDNA文库(complementary DNA library)以组织细胞中的mRNA为模板,反转录合成双链cDNA ,各cDNA分子分别插入载体形成重组子,再导入宿主细胞克隆扩增。这些在重组体内的cDNA的集合即cDNA文库。 cDNA文库仅包含正在表达的基因 不同物种、不同组织的cDNA文库不相同 基因总量少,易筛选 cDNA文库的组建: 基因重组 反转录酶 mRNA cDNA 4、PCR扩增目的基因片段 适用于克隆序列清楚的基因 以基因组DNA为模板,直接进行PCR扩增较难 多采用以mRNA为模板的RT-PCR法 限制性内切酶酶切 酶切 4.3 接 体外重组的策略 人工染色体 酵母人工染色体( YAC )是一类目前能容纳最大外源 DNA片段人工构建的载体。 酵母染色体的控制系统主要包括三部分: 着丝粒:使染色体的附着粒与有丝分裂的纺锤丝 相连,保证染色体在细胞分裂过程中      正确分配到子代细胞 端粒:位于染色体两个末端,保护染色体两端,    保证染色体的正常复制 酵母自主复制序列ARS :与酵母细胞复制有关 YAC优点: 克隆能力非常大 保证所插入外源基因结构的完整性, 大大减少基因库所要求克隆的数目。 YAC 已成为构建高等真核生物基因库的重要 载体,在人类基因组的研究中起着重要作用。 BAC:细菌人工染色体。更便于基因工程操作,在人类基因组研究中正被广泛应用。 (3) 受体细胞 1、定义:外源DNA导入的细胞,是重组体扩增的场所。 2、要求:易于接纳外源DNA 无特异的内源性核酸内切酶 载体复制、扩增不受阻 与载体有互补性 (4)体外重组的策略 1、粘末端连接 1)全同源粘末端连接 最方便简单 高背景-载体自身环化 双向插入 2)定向克隆:使外源基因定向插入到载体中的克隆策略 粘-粘连接:最有效、最快捷 粘-平连接:适用于外源基因仅与载体有一个相同酶切位点,可将另一末端补平 2、平末端连接: 酶切点为平末端或任何两个末端补平的DNA 效率低,酶用量大 3、人工接头连接 人工接头:人工合成含有酶切位点的寡核苷酸片段 4、T-A克隆 T-vector两条链的5’端含有一个游离的T PCR过程中,普通的Taq酶可在产物的3’端多加一个A 基因工程中的工具酶 切割工具-限制性内切酶 Restriction endonuclease 前三个字母来自于菌种名称H. influenzae,“d”表示菌系为d型血清型;“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。 EcoRI—Escherichia coli RI HindⅢ—Haemophilus influensae d Ⅲ SacI (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ) 限制性内切酶酶切 酶切 (1) type II 93% 识别回文对称序列,在回文序列内部或附近切割 3’-OH,5’-P, 需Mg2+,相应的修饰酶需only SAM 识别序列主要为4-6bp, 或更长且呈二重对称的特殊序列 但有少数酶识别更长的序列或简并序列 切割位置因酶而异,有些是隔开的 1. 识别顺序和酶切位点 1)识别4-8个相连的核苷酸 MboI NGATCN;AvaII GG(A/T)CC BamHI GGATCC:PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC; SfiI GGCC N N N N N GGCC CCGGN’N’N’N’N’CCGG Fok I 5’-GGATG(N)9-3’ 3’-CCTAC(N)13-5’ 外侧,产生5’-端突起

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